modRNA技術：一種蛋白表達新方法

顏冰倩 綜述 付煒 審校

【提要】 早在上世紀90年代，注射裸信使核糖核酸（mRNA）已經能夠在體內實現外源性蛋白的表達。然而，mRNA的不穩定性及高度免疫原性阻礙了這項技術的進一步發展與應用。近年來，隨著對mRNA結構的認識深入及核酸技術的進步，可化學合成并修飾信使核糖核酸，即Chemically synthetic modified message RNA（modRNA），modRNA兼具穩定性、低免疫原性及良好的蛋白翻譯表的優勢。我們對其研究現狀、存在問題進行綜述，并對可能的改進方向進行展望。

化學合成修飾信使核糖核酸（Chemically Synthetic Modified Message RNA，modRNA）是指利用化學修飾的堿基在體外合成mRNA，為一種新型的基因載體。該技術以不同修飾的堿基為原料，將含有mRNA生物信息的DNA片段進行體外轉錄以合成modRNA，再經由脂質體或納米顆粒等介質轉入靶細胞中進行蛋白質的翻譯表達，從而實現體內外快速、高效、脈沖式地表達具有生物活性的目標蛋白，以達到治療疾病的目的。

1 modRNA的結構

modRNA通常由5個部分構成，分別是5'-帽結構 （5'-Cap）、5'-非編碼區（5'-Untranslated Region，5'-UTR）、開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）、3'-UTR 和 3'-多聚腺苷酸尾（3'-PolyA Tail）。上述五個部分各司其職，缺一不可：5'-Cap控制翻譯起始，提高翻譯效率；5'-UTR及3'-UTR利于與配體結合，保證翻譯的順利進行；ORF為mRNA的編碼序列，并采用不同修飾的堿基替代正常的A/U/C/G，從而提高其穩定性及表達效率；3'-PolyA Tail則可通過調節長度來進一步控制mRNA的穩定性及降解速率[1]。

2 modRNA的發展歷程

早在1990年，有研究發現向小鼠體內注射裸mRNA能夠實現外源性蛋白的表達。盡管如此，區別“自我”與“非我”的能力是機體識別病原體RNA并發揮免疫應答的基礎，體外轉錄的mRNA能夠結合并激活膜受體Toll樣受體（Toll-like Receptors，TLR）[2-3]及胞內受體視黃酸誘導基因蛋白 I（Retinoic Acid-Inducible Gene I，RIG1）[4]、黑色素瘤分化相關分子 5 （Melanoma Differentiation-Associated Protein 5，MDA5）[5]等受體，從而刺激機體產生大量炎癥介質并啟動級聯免疫效應以清除這種外源性mRNA?？傊?，這種先天性免疫反應的激活不但會影響mRNA在胞內的翻譯表達、加速其剪切及降解，甚至會誘導細胞的凋亡以及組織的結構或功能的損害，造成嚴重的副作用[6]，從而使得該技術的發展與應用受到限制。

病原微生物和線粒體的RNA幾乎不含修飾的核糖核苷酸，而真核生物天然存在多種堿基修飾方式。研究表明，經堿基修飾的modRNA不但能顯著降低體外轉錄mRNA的免疫原性，減少相關炎性因子的產生、抑制細胞毒性、提高細胞存活率，還能大大增強其在細胞內外的穩定性和翻譯表達能力，從而更高效、更持久地表達所需的目的蛋白[7-10]，為基因治療開拓了新思路，并提供了新的方法。Hornung等[4]及Karikó等[7]率先利用含 5-甲基胞嘧啶（m5C）、6-甲基腺嘌呤（m6A）、5-甲基尿嘧啶（m5U）、2-硫尿嘧啶（s2U）和假尿嘧啶（pseudouridine，ψ）等修飾堿基的核糖核苷酸在體外轉錄合成modRNA，模擬真核細胞自身的RNA結構，轉染靶細胞后能夠抑制TLR3/TLR7/TLR8及RIG-1等受體的活化，減少TNF-a、IL-12等炎癥因子和CD80、CD86等免疫共刺激因子的產生，顯著降低了mRNA的免疫原性和細胞毒性。此外，Anderson等[8-9]發現ψ-modRNA能夠通過抑制雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（Double-Stranded RNA-Activated Protein Kinase，PKR）及 2'-5'寡聚腺苷酸合成酶（OAS）的活化來提高自身的穩定性，并促進目的蛋白的翻譯和表達，使得體外合成高質量、穩定且免疫原性低的mRNA成為可能。

不同的堿基修飾方法能夠影響modRNA的免疫原性及翻譯表達能力。因此，對modRNA修飾堿基的研究及改進或許能夠實現調控免疫應答強度及蛋白表達效率的目的。有研究表明，ψ/m5C-modRNA能夠顯著提高蛋白翻譯功能，而m6A/s2U-modRNA 雖免疫原性極低，但轉錄效率也低[7，10]，因而ψ/m5C-modRNA似乎更適合作為基因表達的載體而被廣泛報道。2015年，Andries等[11]報道了一種新的堿基修飾方式N1-甲基假尿嘧啶（N1-methylpseudouridine，m1Ψ），并證明了m1Ψ-modRNA在蛋白表達和免疫原性方面均優于以往的Ψ-modRNA。因此，隨著對新的堿基修飾的不斷發現和功能研究，將來會有更多種類的修飾堿基用于制備出翻譯效率更高、表達效果更好、更為穩定的modRNA。

3 modRNA的優勢

與傳統的質?；虿《净蜉d體相比，modRNA具有其獨特的優勢。由于modRNA進入細胞后無需入核，不依賴細胞的增殖分裂就能發揮作用，因而能夠迅速在各類細胞內翻譯產生目的蛋白，隨后遵循核糖核酸正常的代謝途徑進行降解，由于modRNA為單鏈的RNA，因而整合到宿主基因組的風險非常小，具有極高的安全性[1，12]。同時，modRNA具有良好的可控性，通過調整modRNA的轉染劑量、次數、部位等能夠較好地控制蛋白表達的量、時長及位置，實現短時間、脈沖式地表達所需的目的蛋白。此外，結構改造和堿基修飾的modRNA具有良好的穩定性、低免疫原性、高效的蛋白翻譯能力[8，10-11]。而且，同一種modRNA只需要一個DNA模板，更容易實現低成本、高產量、高效能的工業化生產。

4 modRNA的應用

正是由于mRNA在生物中心法則中扮演的獨特角色，并具有傳遞遺傳信息、表達目的蛋白的承接作用，modRNA技術已迅速成為各領域研究和應用的熱點。

4.1 modRNA與體細胞重編程

因modRNA在機體生長發育、建立疾病模型及細胞自體療法中的獨特優勢，誘導性多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）一直是各領域研究的熱點。2010年，Warren等[13]開創性地體外合成表達Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4這4個轉錄因子的5mC/ψ-modRNA，并將其共同導入多種人體細胞中，最終誘導產生具有全能性的iPSCs，這為重編程及定向分化研究提供了一種全新且安全可靠的方法。2016年，Luni等[14]通過自動化的微流控系統進一步優化了體細胞重編程的微環境，增強了細胞自身及細胞間的自分泌及旁分泌作用，2周時間即可產生純度高、均一性好的iPSCs，兼具成本低、遠程控制等優點，為該技術更好地應用于基礎研究、疾病治療奠定了基礎。值得注意的是，對比逆轉錄病毒，modRNA誘導的iPSCs在轉錄水平更接近于ESCs，這可能與modRNA技術不改變細胞的遺傳性狀有關。

4.2 modRNA與組織再生

在體內外研究中，通過瞬時、高效、脈沖式地表達具有生物活性的旁分泌因子，modRNA能夠有效調控靶細胞的分化、增殖，促進損傷后組織或器官結構及功能的恢復，故可作為組織修復與再生的一種有效治療手段，尤其在心肌再生[15-20]與骨修復[21-23]方面的報道較多。2013年，Lui等[16-17]率先利用編碼VEGF的modRNA，促進心臟祖細胞向血管內皮細胞分化，從而有助于心肌細胞的增殖及存活，與DNA質粒相比，其在減少心梗范圍、改善血供及加快心功能恢復方面效果更好，因而具有良好的臨床應用價值。2018年，Carlsson等[15]進一步利用N1ψ-modVEGF在大型動物體內驗證了modRNA技術在治療心血管疾病方面的可行性。此外，有研究表明，心梗早期注射 modIGF1（胰島素樣生長因子 1，Insulin-like Growth Factor 1）有利于心肌細胞的存活，進而能夠有效地改善心梗的預后情況[18]。但Zangi等[19]利用modRNA技術篩選刺激心外膜脂肪組織形成的旁分泌因子，發現IGF1R信號通路的激活能夠促進心外膜祖細胞向脂肪細胞分化，導致心外膜下脂肪組織沉積，可能誘發心律失常等心血管疾病，故modIGF1在心梗治療的應用尚需充分評估、權衡利弊。

骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）這類細胞因子在調控骨骼生長發育及促進骨修復再生中具有重要作用。modRNA作為一種高效、安全的基因替代技術，在該領域的潛在應用價值也逐漸受到了認可，近年來多篇文獻報道，modBMP-2和modBMP-9結合納米載體能夠有效修復骨缺損，在骨再生中具有巨大的臨床轉化前景[21-23]。

4.3 modRNA與基因治療

迄今為止，各種基因載體在基因缺陷疾病的替代治療和目的蛋白的過表達領域中均取得了顯著成果，modRNA能夠轉染細胞并高效、快速地表達編碼蛋白，隨后被降解清除，不在基因組中留下任何痕跡，這些特征使得該技術在體內外基因替代的研究及治療中具備獨特的優勢。在體外研究中，Wang等[24]通過病人來源的iPSCs構建組織工程心臟補片，經shRNA及crispr/cas9等基因編輯技術敲低或敲除Tafazzin基因（TAZ）來構建巴氏綜合征（Barth syndrome，BTHS）疾病模型，最后利用modRNA技術過表達TAZ來逆轉疾病的進程，以此探索疾病發生發展的病理生理過程，并為臨床藥篩提供依據。在體內治療中，肺表面活性蛋白-B（surfactant protein B，SP-B）缺陷癥是由于機體肺泡Ⅱ型上皮細胞產生SP-B不足引起的一種致死性肺部疾病。2011年，Kormann等[25]讓SPB缺陷的小鼠模型吸入modSP-B，發現能夠有效彌補小鼠體內SP-B的缺失，改善呼吸系統的不良癥狀，顯著提高生存率。此外，modEPO（促紅細胞生成素，Erythropoietin）作為基因治療的另一代表性成果，多項研究均表明，與未修飾的mRNA相比，modRNA能夠顯著提高mRNA的穩定性，抑制機體免疫應答的激活，進而實現更高水平、更長時間的EPO的表達，從而更有效地提高血液中紅細胞水平[26-27]。由此可見，modRNA在疾病發展過程及基因替代性治療的研究中均卓有成效。

4.4 modRNA與疫苗

mRNA作為一種安全高效的基因載體，能夠編碼病毒相關抗原，激活機體免疫系統，進而保護宿主免受病毒侵害，是一種新興的疫苗形式。未經修飾的mRNA能夠有效激活機體的固有免疫反應，增強宿主的抗病毒免疫應答，但也會因其具有的強免疫原性而影響疫苗翻譯表達，最終影響mRNA疫苗的療效。因此，modRNA可能是一種良好的疫苗載體。同時，與減毒或滅活的病原體疫苗、DNA疫苗、蛋白或多糖疫苗對比，modRNA疫苗具有更好的安全性、更優的藥物穩定性或更低的生產成本，便于臨床轉化應用。此外，modRNA疫苗能夠根據患者機體的免疫情況，通過調控編碼區來控制免疫應答強度及特異性，從而達到精準、個性化的計劃免疫的目的。2017年，Nature和Cell均發表了modRNA疫苗在抗zika病毒中應用的報道，modRNA編碼信號肽、zika病毒的前膜蛋白和包膜蛋白后，能夠在宿主體內自組裝成具有免疫原性而無感染能力的病毒樣顆粒，進而激活免疫系統產生特異性免疫應答，最終實現保護小鼠甚至靈長類動物較長時間免受zika病毒感染及損害的目的[28-29]。

此外，隨著腫瘤疫苗研究的興起，modRNA疫苗在腫瘤免疫治療中的作用也逐漸引起了人們的關注，Sahin等[30]及Stadler等[31]利用modRNA編碼個體化突變的多個新表位或雙特異性T細胞誘導抗體，成功招募并激活T淋巴細胞介導的特異性免疫應答，從而達到抑制甚至清除腫瘤的目的。modRNA腫瘤疫苗不僅能夠實現腫瘤治療的個體化，還能夠通過重復注射、持續表達的方式增強抗腫瘤的療效，或許是腫瘤免疫治療的一種新興策略。

5 展望

與未修飾的mRNA相比，雖然modRNA在蛋白表達及免疫原性方面均有明顯的改進，但是如何實現其在體內的靶向傳遞是未來臨床轉化中需要解決的難題之一。modRNA在體內發揮生理功能，不僅涉及如何逃避肝腎的代謝、單核巨噬系統的清除及核糖核酸酶的降解從而有效地向特定組織靶向傳遞，還涉及如何克服mRNA的體積及電荷屏障以最大程度地被細胞吸收利用并實現內涵體逃逸等，進而最大程度地提高modRNA的利用率。新興的生物材料和納米技術的發展為modRNA的有效傳遞提供了一定的技術支持，有研究表明，與常規的陽離子脂質體相比，合理利用納米顆?；螋~精蛋白不僅能夠實現modRNA靶向運輸，還能夠提高細胞攝取率及蛋白表達量，降低細胞的毒副作用[32]，可能是良好的modRNA運載體。

此外，如何控制modRNA的體內降解時間、翻譯效率等從而精確控制目標蛋白的濃度、維持時間等，是modRNA應用于疾病治療時需要面對的另一個問題。未來需要從modRNA結構的改進、新的修飾方法的篩選等多方面進行研究，從而更好地控制目標蛋白的表達。

綜上所述，modRNA作為一種新型的基因表達載體，它能夠實現目的基因瞬時、高效、局部表達，既避免了DNA載體所涉及的基因整合及病毒安全性等問題，也在很大程度上解決蛋白載體半衰期短及強免疫原性引起的過敏反應等問題[12，20]，隨著對modRNA化學結構的深入認識及修飾方式的不斷改進，將進一步促進該技術在不同領域研究中的應用。因此，modRNA技術有望實現真正意義上的技術革新和臨床轉化應用。