氧化單寧酸對豬血漿蛋白水解物水包油乳狀液氧化穩定性的影響

陳益春，姜 帥，牛海力，曹傳愛，孔保華，劉 騫*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在食品加工貯藏過程中，水包油型（oil-in-water，O/W）乳狀液由于其體系的不穩定性易發生氧化現象。在制備乳狀液時，由于均質使油滴的體表面積增大，并在乳化過程中增加了水相的溶氧量，油與水的界面區域為不飽和脂肪酸和親氧化合物（如金屬離子）提供了接觸的可能性[1]，所以導致其在貯存過程易發生脂質氧化。脂質氧化產物會導致食物風味、顏色、質地的不良變化及營養價值的下降[2]，而且形成的一些氧化產物很容易造成人體細胞或組織的損傷。因此，抑制乳狀液食品在貯藏期間氧化至關重要?，F今，食品工業中一般均使用國家批準的化學合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、丁化羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等。但是，隨著經濟發展和生活水平的提高，人們對化學合成抗氧劑的疑慮日益增加。因此，具有高效、綠色、無毒副作用的天然抗氧劑在乳狀液食品中的應用，更加符合消費者的潛在需求[3]。

在過去的10 a間，大量的研究發現，許多動物或者植物蛋白來源的水解物可以作為自由基清除劑、金屬離子螯合劑或者與抑制脂質氧化的物質結合而起到抗氧化的作用[4-5]。在前期研究發現經過堿性蛋白酶水解5 h（重度水解）以后得到的豬血漿蛋白水解物（porcine plasma protein hydrolysate，PPPH）具有很強的自由基清除能力和金屬離子螯合能力[6-7]，而且在模擬脂質體系和肉糜中都表現出良好的抑制脂質氧化的能力[8-9]。但是，由于過長的水解時間產生的大量短肽或者小肽，對水解物的乳化性造成了很大的負面影響[7]。Jung等[10]研究發現，具有較高水解度的水解物大部分都會聚集在連續相中，而非吸附在油水界面上，是造成其較差乳化性的根本原因。另外，Lam等[11]研究發現，具有較大分子質量多肽的水解物中同時含有較多的疏水基團和親水基團，因此在乳化體系的形成過程中，疏水基團能夠與油滴相互結合，而親水基團則通過空間位阻效應穩定整個體系中油滴的大小，從而達到提高乳狀液穩定性的目的。然而，研究還發現，低水解度或者經過堿性蛋白酶適度水解得到的PPPH抗氧化活性一般，主要表現在其自由基清除活性和還原能力較弱[12]。因此，需要對較低水解度的PPPH進行必要的改性修飾，使其在具有較高乳化性的同時，還具有較強的抗氧化活性。

多酚類物質（如單寧酸、茶多酚、綠原酸等）具有較強的抗氧化活性，其與蛋白質之間發生的交互作用在食品加工中能夠賦予產品特殊的性質和狀態[13]。然而，在實際加工條件下，多酚類物質很容易被氧化，從而形成醌類物質。完全氧化的單寧酸能夠作為一種良好的交聯劑，用于改善蛋白質的功能性質。其氧化形成的鄰苯醌通過側鏈反應形成二聚物，此外，還能夠與賴氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸殘基中親核性基團反應，通過這些活性基團誘導多肽分子交聯[14]，從而提高水解物乳化能力。Strauss等[15]研究發現，氧化多酚類物質能夠與蛋白質發生交聯反應，形成穩固的分子結構，從而提高蛋白的功能性質。另外，Kim等[16]研究發現，多酚類物質（阿魏酸和焦性沒石子酸）的氧化能夠顯著提高其抗氧化能力。與此同時，Intarasirisawat等[17]研究發現，利用氧化多酚修飾后的箭魚籽蛋白水解物制備乳狀液，能夠顯著抑制乳狀液在貯藏期間脂質氧化的發生，而且顯著提高乳狀液在貯藏期間的物理穩定性。

基于此，本實驗主要研究添加氧化單寧酸（oxidised tannic acid，OTA）能否提高以適度水解得到的PPPH作為乳化劑所制備的O/W型乳狀液的氧化穩定性，分析探討整個乳狀液在貯藏期間的初級及次級脂質氧化產物的變化趨勢，并利用熒光光譜分析色氨酸熒光強度和蛋白氧化產物的變化趨勢。為PPPH和OTA在復雜的乳狀液類食品體系中的應用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血漿蛋白粉（蛋白質量分數70%） 黑龍江北大荒肉類有限公司；堿性蛋白酶 丹麥Novozymes公司；菜籽油 恒大興安有限公司；單寧酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、異辛烷、異丙醇、正丁醇等均為國產分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；DK-8B熱恒溫水浴鍋 上海驚宏實驗設備有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新徑儀器有限公司；GL-21M冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；T18勻漿機 德國IKA公司；UT-1800紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；JY92-IIN超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-380型熒光分光光度計 天津港東科技發展股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPPH的制備

參照Liu等[7]的方法將經過預熱處理（95 ℃、5min）的豬血漿蛋白水溶液（質量分數4%、pH 8.0）加入堿性蛋白酶（酶與底物質量比為2∶100）置于55 ℃水浴水解1 h。水解過程以1 mol/L NaOH溶液調節pH值保持恒定（pH 8）。水解結束后95 ℃水浴5 min進行滅酶，用1 mol/L HCl溶液將水解液pH值調至7.0。水解物于9 000×g離心10 min除去懸浮物。

1.3.2 OTA的制備

參照Aewsiri等[18]方法制備OTA。單寧酸（2 g/100 mL）溶于蒸餾水，用1 mol/L NaOH溶液將pH值調至9。隨后40 ℃條件下溶液通入高純度氧氣（99.5%）1 h，以確保單寧酸氧化為OTA。

1.3.3 PPPH乳狀液的制備

菜籽油與PPPH溶液（質量分數4%、10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液、pH 7.0）以體積比1∶9混合，用高速均質機在13 500 r/min均質2 min。然后將粗乳狀液置于20 kHz，70%能量的條件下超聲3min。然后，分別加入基于PPPH質量分數的OTA（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%），再用高速均質機在13 500 r/min均質30 s。與此同時，在制備粗乳狀液時，加入NaN3（0.2 g/L）作為抑菌劑。

1.3.4 脂質過氧化值測定

參照Uluata等[19]方法，采用硫氰化鐵法測定乳狀液于37 ℃貯藏條件下的脂質過氧化值（peroxidation value，POV）。取0.3 mL乳狀液與1.5 mL異辛烷-異丙醇（3∶1，V/V）混合，旋渦振蕩10 s（3 次）。1 000×g離心2 min后取0.2 mL有機相與2.8 mL甲醇-正丁醇（2∶1，V/V）混合，并加入15 μL、3.97 mol/L的硫氰酸銨和氯化亞鐵溶液。室溫反應20 min，于510 nm波長處測吸光度。以過氧化氫異丙苯做標準曲線，確定樣品中的POV。

1.3.5 共軛二烯烴含量測定

參照Viljanen等[20]方法測定乳狀液的共軛二烯烴（conjugated diene，CD）。取100 μL乳狀液與1.5 mL異辛烷-異丙醇（3∶1，V/V）混合，旋渦振蕩10 s（3 次）。548×g離心5 min獲得有機相，取0.2 mL用異辛烷稀釋到5 mL，混勻后234 nm波長處測量吸光度。CD值由下式計算：

式中： ε 為摩爾消光系數（25 200 L/（mol·cm））；b為光程長度；A為吸光度。1.3.6 TBARS值測定

參照Intarasirisawat等[17]方法測定TBARS值。取1 mL乳狀液與1 mL水及4 mL TBARS溶液混合（0.375 g TBARS、15 g三氯乙酸、1.76 mL 12 mol/L鹽酸、82.9 mL水及3 mL 2% BHA溶液混合），沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，取上清液于532 nm波長處測吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷做標準曲線，確定樣品中的TBARS值。

1.3.7 熒光光譜分析

參照Estévez等[21]的方法檢測色氨酸熒光損失及蛋白質氧化產物（FP）熒光強度的變化情況。乳狀液（檢測色氨酸時取100 μL，FP取250 μL）用5mL磷酸鹽緩沖溶液稀釋（pH 7.0，0.01 mol/L）后置于石英熒光比色皿中。熒光參數：激發波長為283 nm時，記錄300～400 nm間色氨酸發射光譜；激發波長為350 nm時，記錄400～500 nm間FP發射光譜。其中，激發和發射狹縫寬度設置為10 nm，以 240 nm/min的速率收集數據。

1.4 統計分析

每個實驗重復3 次，結果表示為 ±s。數據統計分析采用Statistix 8.1（分析軟件St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用sigmaplot12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 POV分析

圖1 不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間POV的影響Fig. 1 Effect of OTA incorporation on POV of oil-in-water emulsion during storage

如圖1所示，在37℃避光貯藏期間，所有樣品POV大體上都呈現顯著增加的變化趨勢（P＜0.05），其中，不添加OTA的PPPH乳狀液的POV相比于其他實驗組增加幅度較大，且在第7天POV達到最大，為6.13 mmol/kg。而添加基于PPPH質量分數0.5%、1%、1.5%的OTA乳狀液POV在第7天僅為2.47、2.04、1.77 mmol/kg，并且乳狀液的POV隨著OTA添加量的增加而下降。一方面，脂質氫過氧化物的親水親油性決定了其主要位于油水界面處[22]，而乳化后添加OTA促進了界面處PPPH的吸附，使得更多的PPPH可以通過提供氫離子結合油脂氧化過程中的脂肪酸自由基，并將其轉化為穩定化合物而終止自由基鏈式反應，所以提高了氧化穩定性。而且界面處較多的肽可以減少油相和水相中金屬離子的接觸，從而有效地抑制金屬氧化的發生[23]。此外，OTA的添加提高了油滴表面肽膜的厚度，從而形成致密的物理屏障而抑制氧的接觸和滲透。另一方面，OTA可以誘導水相中PPPH分子內或分子間肽交聯，使負電荷殘基被屏蔽，導致負電荷的增多，這就意味著其可以與水相中帶正電荷的Fe2+反應而減少促氧劑與脂質反應從而抑制氫過氧化物的形成。只添加PPPH及0.1% OTA的兩組乳狀液在貯藏后期POV出現下降趨勢，這表明其乳化體系初級氧化完全后分解產生了次級氧化產物，氧化酸敗的初始產物會分解產生醛、酮等小分子有害化合物，且氫過氧化物的生成速度小于其分解速度，而其他3 組POV依然呈現上升趨勢，且POV一直較未添加OTA組低，該結果顯示雖然PPPH作為天然抗氧化肽可以提高乳狀液的氧化穩定性，但通過適量添加OTA可以在此基礎上更加顯著地減少氫過氧化物的形成。

2.2 CD值分析

不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間CD值的影響如圖2所示。在10 d貯藏期間，所有樣品CD呈現顯著的上升趨勢，且添加OTA的PPPH乳狀液CD值較只添加PPPH的顯著降低（P＜0.05）。隨著OTA質量分數的增加，脂質氧化產生的CD含量顯著減少（P＜0.05），其中，添加1.5% OTA的PPPH乳狀液CD值在第10天僅為26.92 μmol/L。這可能是因為添加OTA提高了油水界面的PPPH覆蓋率，不僅使更多的抗氧化氨基酸殘基暴露于界面處，而且其疏水性末端減少了自由基與油脂不飽和脂肪酸的接觸[24]，抑制了不飽和脂肪酸氧化產生CD。鑒于油脂氧化主要發生于油水界面處，PPPH作為天然活性肽具有一定的抗氧化性，再次證明了OTA修飾的PPPH富集在氧化反應頻繁發生的油水界面處。此外，OTA修飾的PPPH相互交聯，在油滴表面形成較強的薄膜不僅可以阻礙氧的滲透和擴散，而且降低了乳狀液液滴的絮凝，增加了液滴表面積處的抑氧物質的附著，從而減少脂質與金屬離子反應。如圖1和圖2所示，相比于只添加PPPH的乳狀液，乳化后添加OTA可以顯著降低氧化初級階段的氫過氧化物和CD含量（P＜0.05），提高PPPH乳狀液的氧化穩定性。

圖2 不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間CD值的影響Fig. 2 Effect of OTA incorporation on CD value of oil-in-water emulsion during storage

2.3 TBARS值分析

脂質氧化通過自由基鏈式反應機制進行，其氧化過程中間產物較多，其中以醛類化合物——丙二醛研究最為突出[25]。不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間TBARS值的影響如圖3所示。乳狀液的TBARS值隨貯藏期的延長而增加，這與初級氧化POV及CD值變化趨勢相一致。其中，只添加PPPH和0.1% OTA的乳狀液在1～7 d貯藏期內表現較明顯的TBARS值增加趨勢，這說明雖然PPPH具有抗氧化活性，但其抗氧化效率較低，與之前的研究結果相一致[8]。而添加質量分數0.5%、1%、1.5% OTA的PPPH乳狀液的TBARS值增加幅度很小，第10天時，與只含PPPH乳狀液的TBARS值相比（9.81 mg/L，以丙二醛計），基于PPPH添加0.5%、1%、1.5% OTA的乳狀液的TBARS值僅為1.47、1.41、1.1 mg/L，該結果表明乳化后添加OTA可顯著降低乳狀液TBARS值（P＜0.05），明顯抑制次級氧化，提高了乳化體系的氧化穩定性。有研究顯示，氧化酚類化合物與蛋白相互作用相比于水相中游離酚可以更好地延緩脂質氧化[26]。圖3揭示了OTA修飾的PPPH很好地抑制了丙二醛的形成，但是除丙二醛以外，初級氧化產物氫過氧化物還會分解成其他羰基化合物，在后續實驗會進一步研究探討OTA修飾的PPPH的抗氧化效果。此外，液滴大小、表面積、所帶電荷及界面膜的厚度對乳狀液氧化穩定性都有影響[27]。添加OTA的乳狀液液滴表面覆蓋水解物較多，減少了體系中游離脂肪酸與過渡金屬離子的接觸，也就避免了過度金屬促進脂質氫過氧化物分解成高活性自由基（烷氧基、過氧自由基）及副產物（醛、酮、醇）[28]。Aewsiri等[18]研究發現OTA修飾的墨魚魚皮提取物相比于只添加提取物乳狀液的TBARS值顯著降低，盡管提高了乳狀液中提取物的添加量，但對丙二醛的形成抑制作用依然較低。Intarasirisawat等[17]研究表明，添加OTA的魚卵蛋白水解物（skipjack roe protein hydrolysate，SRPH）乳狀液O/W界面蛋白多，界面膜較厚，形成的OTA-SRPH復合物可以抑制體系脂質氧化，顯著地提高了乳狀液的氧化穩定性，這與本實驗的研究結果相吻合。

圖3 不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間TBARS值的影響Fig. 3 Effect of OTA incorporation on TBARS value of oil-in-water emulsion during storage

2.4 色氨酸熒光光譜分析

在貯藏期間，氨基酸的降解會引起色氨酸熒光損失，通過色氨酸熒光強度的變化可以間接反映乳狀液蛋白氧化情況。不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間色氨酸熒光強度變化的影響如圖4所示。所有乳狀液樣品在貯藏期間色氨酸熒光強度呈現顯著下降的變化趨勢（P＜0.05）。最初色氨酸熒光強度取決于乳狀液中PPPH的含量，新鮮乳狀液中隨著OTA質量分數的提高，色氨酸熒光強度顯著降低（P＜0.05），這是由于大部分色氨酸位于親脂的蛋白表面[29]，還有一部分位于蛋白結構內部，添加OTA后提高了油滴表面PPPH覆蓋率，減少了暴露于水相中的色氨酸。而在貯藏期間，乳化體系中的金屬離子（如Cu2+）可誘發色氨酸分解為自由基，直接與氧分子產生色氨酸過氧自由基，而通過蛋白覆蓋于油滴表面的色氨酸會最先受脂質氧化的影響，導致這些自由基與脂質反應生成過氧化物。簡單地來說，隨著脂質氧化的進行，色氨酸隨之降解損失，色氨酸熒光強度減弱。此外，色氨酸熒光強度的降低也有可能是氧化酚類芳香環與酪氨酸或色氨酸反應導致其熒光強度的降低[30]。

在貯藏期間，添加0.1% OTA的PPPH乳狀液色氨酸熒光強度最高，且在貯藏期內該樣品色氨酸熒光強度下降幅度最大，其發射光譜變化如圖5所示。在283 nm激發波長處，色氨酸在340～360 nm發射波長處有最大峰值。色氨酸波峰隨貯藏期延長而下降，且在貯藏后期下降較為明顯，這是由于后期脂質初級氧化產物的增加，導致色氨酸殘基與其反應產生蛋白氧化產物。Estévez等[17]發現色氨酸熒光損失與CD值呈負相關，脂質初級氧化產物越多，色氨酸氧化降解程度越大，熒光強度隨之下降，這與本實驗研究結果相一致。此外，酪氨酸殘基易受到氧化修飾，這就導致其在310 nm波長處熒光強度下降。

圖4 不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間色氨酸熒光強度的影響Fig. 4 Effect of OTA incorporation on tryptophan fluorescence intensity of oil-in-water emulsions during storage

圖5 添加0.1%OTA的PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間色氨酸熒光發射光譜的變化Fig. 5 Tryptophan fluorescence emission spectra of oil- in-water emulsion with 0.1% OTA added during storage

2.5 蛋白氧化熒光光譜分析

在貯藏期間，隨著乳化體系脂質氧化產物的形成及氨基酸氧化降解導致了蛋白次級氧化產物的形成。不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間FP熒光強度的影響如圖6所示。所有乳狀液樣品在貯藏期間FP熒光強度呈現顯著上升的變化趨勢（P＜0.05）。隨著OTA質量分數的增加，熒光蛋白氧化產物形成量隨之減少。在氧化初期，色氨酸、酪氨酸氧化降解并與脂質初級和次級氧化產物反應形成FP，所以FP熒光強度的增加與色氨酸熒光損失的結果相吻合。同一貯藏時間內，隨著OTA質量分數的增加，FP熒光強度顯著下降（P＜0.05），含0.1% OTA的PPPH乳狀液的熒光強度是1.5% OTA實驗組的1.5 倍。這是由于較高質量分數的OTA提高界面PPPH含量抑制脂質初級和次級氧化產生，間接減少了脂質氧化產物與PPPH反應生成FP。此外，肽鏈上的自由氨基與脂質次級氧化產物如醛類也可以導致熒光蛋白氧化產物的形成[31]。

其中，添加0.1% OTA的PPPH乳狀液FP熒光強度最高，這說明其形成的次級熒光蛋白氧化產物最多，該乳狀液貯藏期間FP熒光強度變化如圖7所示。在350 nm激發波長處，FP在410 nm左右發射波長處有最大吸收峰值，且FP波峰隨貯藏期延長而上升。在色氨酸氧化降解的同時，肽鏈上的其他芳香族氨基酸、含硫氨基酸的自由基與脂質氧化產物結合導致FP的增加[32]。

圖6 不同質量分數OTA的添加對PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間FP熒光強度的影響Fig. 6 Effect of OTA incorporation on FP fluorescence intensity of oil-in-water emulsion during storage

圖7 添加0.1%OTA的PPPH制備的O/W型乳狀液在貯藏期間FP熒光發射光譜的變化Fig. 7 FP fluorescence emission spectra of PPPH prepared oil-in-water emulsion with 0.1% OTA added during storage

3 結 論

本研究主要針對添加不同質量分數的OTA對以適度水解得到的PPPH作為穩定劑所制備的O/W型乳狀液貯藏期間氧化穩定性的影響進行深入研究。通過測定乳狀液在貯藏期間（0～10 d）的POV、CD、TBARS值以及色氨酸熒光強度和FP的變化趨勢發現，隨著OTA添加量的增加，明顯降低了乳狀液中POV、CD以及TBARS值。同時，色氨酸熒光強度和FP結果顯示，添加OTA以后，能夠明顯提高整個乳狀液在貯藏期間的氧化穩定性，而且存在添加質量分數依賴關系。因此，本實驗為OTA在以蛋白水解物為乳化劑的乳狀液中合理應用提供一定的參考依據。