β-胡蘿卜素膠體分散體系的制備及其顯色特性

吳彬嫻，林展拓，高志明,2，楊 楠,2，方亞鵬,2,*

（1.湖北工業大學 菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068）

β-胡蘿卜素通常存在植物體和一些動物體內[1]，其分子式為C40H56，相對分子質量為536.88，由11 個共軛雙鍵和2 個β-紫羅酮環組成，在食品中常作為色素使用[2]。但由于β-胡蘿卜素自身不溶于水，并且對光、氧、熱敏感，其在食品工業中的應用受到極大的限制[3-4]。

β-胡蘿卜素的分子結構對其顯色起著重要作用。其分子中的碳碳雙鍵是一種發色團，當分子內有2 個或2 個以上的發色團共軛時，其對光的吸收波長可移到可見光區。另外，β-胡蘿卜素的顯色性也與其在食品中存在的顆粒大小、順反異構體的含量以及晶型密切相關[5]。根據順反異構的類型及含量不同，β-胡蘿卜素可表現為黃色、橘色或紅色，在波長400～500 nm處有最大吸收峰。相關研究表明，在膠體顆粒中，β-胡蘿卜素有2 種存在形式，H型聚合體和J型聚合體[6-9]。單純的H型聚合是由4 個β-胡蘿卜素分子平行排列形成，這種排列形式的吸收光譜會發生約44 nm的藍移；而J型聚合是指β-胡蘿卜素分子呈人字形或首尾相連的排列聚集[10]，這種排列形式的吸收光譜會發生約44 nm的紅移或7 nm的藍移。另外，顆粒在體系中的粒徑分布不同，導致顆粒在體系中對光的吸收和散射不同。當顆粒粒徑（r）遠小于光的波長時（2πr/λ＜＜1），光的散射符合瑞利散射，即光散射強度變小，顏色的亮度降低，隨顆粒的粒徑逐漸增大，色彩的飽和度會下降，顏色變暗[11-13]。隨顆粒的粒徑進一步增大（2πr/λ≥1），光的散射符合米氏散射，短波長的光發生散射，散射光的強度與光的波長之間的關系不再顯著。體系的顏色主要受顆粒的比表面積和其對光的吸收影響。

食品體系實際上屬于膠體體系，其具有多相、多組分、多尺度的特性。多數情況下，食品體系處于亞穩態，易發生聚集、沉降、絮凝等現象，并由此導致食品的顏色、質構、口感的變化[14-17]。本實驗在親水環境中制備不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒，研究不同粒徑分散體系的吸光和顯色性的區別。通過卡拉膠凝膠固化，使不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒分散體系得以穩態化，為其作為食品著色劑的應用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素（純度93%） 浙江醫藥股份有限公司；Gelcarin GP-911NF κ-卡拉膠 美國FMC公司；吐溫80（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VCX800超聲波細胞粉碎儀 美國Sonics公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；PT-MR 2011型高速剪切乳化機 瑞士Kinematica公司；LGJ-12型冷凍干燥機 鄭州宏朗儀器設備有限公司；CM3500d型色度儀 日本柯尼卡美能達公司；BT-1600型光學顯微鏡 丹東百特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-胡蘿卜素的超聲分散及表征

將質量分數0.1%的β-胡蘿卜素粉末加入到質量分數0.5%的吐溫80溶液中，冰水浴超聲分散10 min，防止超聲過熱致使β-胡蘿卜素降解。每隔1 min定時取樣進行粒徑分析和其他表征。超聲功率設置為40%（總功率800 W），系統運行和間隔時間設置為1 s。

經超聲分散的β-胡蘿卜素膠體顆粒的形貌采用透射電子顯微鏡觀察。將β-胡蘿卜素分散液用去離子水稀釋至0.05%，取10 μL稀釋液滴于銅網上，待水分揮發后用質量分數3%磷鎢酸溶液進行負染，揮干后在透射電子顯微鏡下觀察。

取β-胡蘿卜素分散液200 μL加4 800 μL去離子水稀釋后于TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計中進行全波段掃描以探究不同粒徑β-胡蘿卜素在體系中的特征吸收峰的區別。以不添加β-胡蘿卜素的稀釋液為空白對照，波長寬度1 nm，慢速掃描，波長范圍為200～900 nm進行全波長掃描。

粒徑在25 ℃條件下測量，取β-胡蘿卜素分散液200 μL加4 800 μL去離子水后搖勻，吸取1 mL的稀釋液于樣品池中。每個樣品測量3 次并取平均值。

1.3.2 β-胡蘿卜素膠體分散體系的制備及表征

在85 ℃條件下將超聲后的β-胡蘿卜素分散液以體積比1∶10加入到不同質量分數（0.2%～1.2%）的卡拉膠溶液（含0.1 mol/L KCl）中混合均勻，然后置于冰水中冷卻，以體系無法自由流動為準，直到體系完全凝固。采用高速剪切將含有β-胡蘿卜素膠體顆粒的凝膠在2 000 r/min轉速下剪切粉碎，使體系中無肉眼可見的大塊凝膠以便凍干。經凍干后得到含有β-胡蘿卜素的固體粉末，粉末主要由卡拉膠和β-胡蘿卜素組成，且含有少量的KCl。

采用光學顯微鏡觀察凝膠微觀結構。將凍干后的β-胡蘿卜素凝膠粉末分散于去離子水中，取少量分散液置于載玻片上進行微結構觀察。

1.3.3 色值分析

將凍干后的β-胡蘿卜素膠體分散體系的粉末復溶后在柯尼卡美能達CM3500d型色度儀上進行透射光譜和L*、a*、b*值測定。其中透射光譜測定波長范圍為350～750 nm。運用D65觀察視場下測定CIE色度空間中的色度坐標L*、a*、b*值和透光率。

1.3.4 穩定性分析

將凍干的膠體粉末復溶為1%的分散液置于室溫條件下進行不避光、不除氧貯藏，每1 d測定β-胡蘿卜素含量。取1 mL膠體分散液于離心管中，加入6 mL正己烷振蕩萃取。靜置待混合物分層后取上層清液在波長450 nm處測定吸光度。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Orign 8.0軟件進行分析。通過BT-1600圖像顆粒分析系統觀察復溶后的膠體分散體系粉末。

2 結果與分析

2.1 超聲對β-胡蘿卜素膠體顆粒形貌的影響

如圖1所示，超聲時間為1 min時（圖1A），β-胡蘿卜素在吐溫80溶液中呈塊狀，且顆粒形狀各異、大小不一。但β-胡蘿卜素晶體的微觀特征清晰可見，呈現出細條狀紋路。超聲時間為5 min時（圖1B），分散體系中大部分β-胡蘿卜素呈均勻的球狀顆粒，且粒徑變小。而在水中超聲5 min后（圖1C）的β-胡蘿卜素顆粒較大，且尺寸不一，在放置過程中顆粒極易聚集而產生沉降。說明超聲能使β-胡蘿卜素在水相中形成納米顆粒，但由于較強的表面疏水性，這種顆粒在水相中容易發生聚集。而吐溫80能與β-胡蘿卜素顆粒間通過疏水相互作用從而有效阻止其疏水聚集[18]。

圖1 超聲處理后β-胡蘿卜素顆粒的透射電子顯微鏡圖Fig. 1 TEM of β-carotene particles after ultrasonication

2.2 超聲對β-胡蘿卜素膠體顆粒的粒徑和顯色性的影響

圖2 不同超聲時間β-胡蘿卜素分散液粒徑（A）、粒徑分布（B）、外觀（C）和紫外-可見全波段掃描（D）Fig. 2 Changes in particle size and color properties of β-carotene dispersions during ultrasonication

如圖2A所示，隨超聲處理時間的延長，β-胡蘿卜素的粒徑逐漸減小，并在5 min后趨于穩定，此時的粒徑約為（164±1）nm。從圖2B可以看出，隨著超聲處理時間延長，β-胡蘿卜素的粒徑分布主峰由較大粒徑向較小粒徑方向逐漸移動，并在5 min后趨于穩定。與圖2A所呈現的趨勢一致。綜合兩圖，β-胡蘿卜素顆粒在超聲處理5 min后其在水相中的分散性達到穩定。

如圖2C所示，隨著超聲時間延長，β-胡蘿卜素的外觀顏色先逐漸由橙紅色變為橙黃色（1～5 min），后隨著超聲時間的進一步延長，色澤變化不再明顯（5～10 min）。

如圖2D所示，所有樣品均在330～350 nm處有最大吸收峰，此處吸收峰為β-胡蘿卜素順式異構體所致；隨著超聲處理時間延長，粒徑變小，β-胡蘿卜素特征吸收峰（400～500 nm）逐漸增高；535 nm為結晶型β-胡蘿卜素的吸收峰。這可能是由于結晶型的β-胡蘿卜素是以全反式異構體為主，而無定型的β-胡蘿卜素以順式異構體為主[19]。在本體系中，隨粒徑減小，β-胡蘿卜素特征吸收峰（450 nm左右）出現藍移。分散體系中顆粒的大小在一定程度上也可以影響體系的色澤，根據Kubelka-Munk[20-22]理論，當顆粒的粒徑足夠小時，光散射減小，體系的明亮程度也會降低。這也是超聲導致色澤改變的原因之一。

2.3 卡拉膠質量分數對β-胡蘿卜素分散體系穩定性的影響

圖3 不同質量分數卡拉膠穩定的β-胡蘿卜素分散顆粒凝膠、粉末及復溶后（A）和微觀形貌（B）Fig. 3 Appearance (A) and microstructure (B) of β-carotene colloids stabilized with different concentrations of kappa-carrageenan

卡拉膠凝膠形成過程中，其分子之間通過交聯而形成三維網絡結構[23-27]。本研究利用這一原理，將超聲形成的β-胡蘿卜素顆粒固定在卡拉膠網絡結構中，防止其發生進一步聚集沉降，從而實現穩態化?？ɡz質量分數越高，其形成的三維網絡結構越致密[23]，其對β-胡蘿卜素的穩定能力有所不同。由圖3A可知，卡拉膠質量分數在0.6%以下時，凝膠網絡較為稀疏，β-胡蘿卜素顆粒不能被很好地穩定，復溶前后顏色差別較大。當卡拉膠質量分數在0.8%以上時，β-胡蘿卜素顆粒能夠被較好地穩定。從圖3B能夠看出，卡拉膠質量分數較低時（＜0.6%），在靜置的過程中β-胡蘿卜素顆粒發生聚集和沉降，其在顯微鏡下表現為大塊的β-胡蘿卜素顆粒不均勻地分散于體系中。如圖3B中箭頭所指的黑色顆粒即為在靜置過程中發生了聚集的β-胡蘿卜素顆粒，當卡拉膠質量分數為0%時，視野中可見較大塊的β-胡蘿卜素顆粒；隨著卡拉膠質量分數的增加，視野中可見的β-胡蘿卜素顆粒逐漸變少。當卡拉膠質量分數較高（0.8%～1.2%）時，β-胡蘿卜素顆粒均勻分散在凝膠體系中，未見明顯聚集顆粒。同時，視野中可見半透明的卡拉膠凝膠，說明高質量分數卡拉膠凝膠對β-胡蘿卜素顆粒具有較好的穩定效果。

2.4 β-胡蘿卜素膠體分散體系的色值分析

圖4 不同超聲時間的膠體分散體系復溶后的色值分析Fig. 4 Color properties and appearance of re-dispersed β-carotene colloids

如圖4A所示，在400～500 nm波長范圍內，隨超聲時間延長（β-胡蘿卜素顆粒粒徑減?。?，膠體分散體系的分光透過率減小。說明在此波長范圍內，體系對光的吸收隨粒徑減小而增大，這與全波長掃描圖譜的結果一致。此外，隨超聲時間的延長，顆粒粒徑減小，顆粒表面的分子數的比表面積增大，體系的透光率就會減小[22]。如圖4B所示，體系的L*值隨粒徑的變小而變低，這可能是由于光散射強度隨粒徑減小而變小造成的。光散射強度越弱，體系對光的反射越弱，體系顏色更暗、顏色變深。同樣通過a*、b*值可以發現，體系a*、b*值隨粒徑減小而增大，體系顏色向紅光、黃光方向偏移。在圖4C可以明顯看出，體系的顏色逐漸由淡紅變為橘紅。這與β-胡蘿卜素分散液（未被卡拉膠凝膠穩定時，圖2C）的外觀變化趨勢一致。

2.5 β-胡蘿卜素穩定性分析

圖5 不同超聲時間的膠體分散體系復溶后的貯藏穩定性Fig. 5 Stability of β-carotene dispersions with different ultrasonication times during storage

如圖5所示，β-胡蘿卜素膠體分散體系中β-胡蘿卜素的降解速率隨其粒徑降低而加快。β-胡蘿卜素的降解通常受諸多因素影響，如貯藏溫度、pH值和離子強度等[28-29]。除此之外，與β-胡蘿卜素所處體系的多孔性和水分活度也密切相關。當體系的孔隙較小，孔隙壁較薄時，β-胡蘿卜素更易于暴露于更多的氧中，從而加速了β-胡蘿卜素的降解[30]。本實驗體系中采用了相同的卡拉膠凝膠穩定β-胡蘿卜素顆粒，因此影響體系中β-胡蘿卜素降解速率的因素主要為粒徑。由于卡拉膠凝膠時形成了空間網狀結構，離子和氧等可以較為自由地在體系中運動，且β-胡蘿卜素比較均勻地分散在體系中，粒徑較小的β-胡蘿卜素顆粒比粒徑較大的β-胡蘿卜素顆粒具有更大的比表面積，小顆粒的β-胡蘿卜素比大顆粒的β-胡蘿卜素接觸到更多的氧、離子和光，在貯藏的過程中，氧化更快。但在工業化應用的過程中，可適量添加抗氧化劑（如VC、VE）防止β-胡蘿卜素的氧化。

3 結 論

本實驗通過不同超聲時間得到了不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒，并對其顯色性進行了表征。進一步采用卡拉膠凝膠對β-胡蘿卜素顆粒進行穩定，得到了適合添加至食品中的β-胡蘿卜素膠體分散體系。隨超聲時間的延長，β-胡蘿卜素顆粒的粒徑減小，其顏色由紅色向橘色轉變，亮度降低。較高質量分數的卡拉膠凝膠（＞0.8%）能對β-胡蘿卜素顆粒起到穩態化的效果。隨著β-胡蘿卜素顆粒粒徑的減小，其在凝膠中的降解速率增加。本實驗研究結果表明，食品體系的顏色不僅可以通過著色劑的種類、濃度來改變，也可以通過對著色劑的形態、粒徑的調控來改變。