高掛草中多糖的提取純化和活性研究

張心慧

高掛草為松蘿科松蘿屬的破莖松蘿(UsneadiffractaVain)全株，又叫節松蘿。高掛草為藻和菌共生的地衣體，我國高掛草分布廣泛，主要分布于東北及山西、內蒙古、陜西等地。目前多為裕固族人常用草藥之一[1]，高掛草寄生在海拔2 500 m以上的松柏樹上，是地方性民間藥材。高掛草具有較強的活血化瘀、消炎止疼、祛濕止癢的功效[2]，因此常在中醫藥領域應用。目前關于高掛草的研究較少，大部分是對其全株的中藥藥用價值進行研究，而對高掛草多糖的研究卻鮮見報道。常見的植物多糖都有明顯的機體調節功能和防病作用，但人們對高掛草多糖卻知之甚少。因此，本文以高掛草為原料，對多糖的抗氧化性和抑菌性進行研究，為其藥用價值應用提供基礎理論依據。

1 材料、儀器設備與試劑

1.1 材料

試驗材料：高掛草(采自云南)；供試菌：大腸桿菌、黑曲霉、枯草桿菌、酵母菌、根霉(由吉林農業科技學院微生物實驗室提供)。

1.2 儀器設備

低速離心機(KDC-1044型，科大創新股份有限公司中佳分公司)、電子分析天平(FA2004A型，上海精天)、電熱鼓風干燥箱(DHG-9240A型，上海一恒科技有限公司)、紫外分光光度計(UV-9100型，上海光譜儀器有限公司)、數顯恒溫水浴鍋(HH-8型，金壇市晶玻實驗儀器廠)、恒溫振蕩培養箱(HZQ-X100A型，上海一恒科技有限公司)、真空泵、透析袋、超凈工作臺、培養皿、研缽、接種環、血球計數板、涂布器、移液槍、移液管、容量瓶、燒杯、試管、三角瓶。

1.3 試劑及配制

1.3.1 試劑 鄰苯三酚、鹽酸、Tris、無水乙醇、乙醚、水楊酸、30%H2O2、FeSO4·7H2O、三氯甲烷、正丁醇、DPPH、NaOH、NaCl、HCl均為分析醇，無菌生理鹽水、蒸餾水等。

1.3.2 試劑的配制 (1)0.1 μmol·L-1的DPPH溶液的配制：用電子天枰稱量1.81 mgDPPH，在25 mL容量瓶中用無水乙醇定容。取10 mL定容后的液體再用無水乙醇將其稀釋2倍，可得到0.1 μmol·L-1的DPPH(避光保存)。(2)Tris-HCl緩沖液的配制：先用移液槍量取2.1 mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至250 mL得到0.1 mol·L-1HCl溶液，再用電子天枰稱取三羥甲基氨基甲烷3.0285 g，加蒸餾水溶解，再向該液體中加入114.5 mL 0.1 mol·L-1HCl溶液，用蒸餾水定容至500 mL，得到pH=8.2，濃度為50 mmol·L-1的Tris-HCl緩沖液。(3)25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液的配制：用電子天枰稱取0.315 g鄰苯三酚，定容至100 mL。(4)8 mmol·L-1HCl溶液的配制：用移液槍量取0.067 mL濃鹽酸，定容至100 mL。(5)6 mmol·L-1Fe2+的配制：用電子天枰稱取FeSO4·7H2O 0.0167 g，用蒸餾水定容至100 mL。(6)6 mmol·L-1水楊酸-乙醇的配制：用電子天枰稱取水楊酸1 g，用無水乙醇45mL溶解。(7)6 mmol·L-1H2O2溶液的配制：用移液槍量取濃度為30% H2O20.3 mL，定容至500 mL。

2 試驗方法

2.1 高掛草多糖的提取純化

用研缽將高掛草研磨成粉末備用(不能使用粉碎機，因為高掛草粉末的質量較輕容易飛散浪費材料)。稱取16.0 g高掛草粉末，先加入乙醚脫色，乙醚的用量沒過高掛草粉末即可。脫色過程中乙醚易揮發適當時再補加入一定量乙醚(乙醚有毒試驗時開窗通風保證安全)。脫色后加入80 mL蒸餾水，間歇攪拌，紗布過濾，過濾后的濾液待用，濾渣用同樣的方法再重復煮沸3次后，合并濾液。抽提濾液再次除去濾渣得到清澈的提取液。將得到的提取液在放著石棉網的電磁爐上煮沸濃縮至24 mL。用1 mol·L-1NaOH溶液調節提取液的pH至8.0后用H2O2脫色[3]。脫色后的提取液用Sevage法去除雜蛋白(加入等體積的三氯甲烷和正丁醇的混合液，混合液的體積比是三氯甲烷∶正丁醇=4∶1，然后震蕩20 min)[4]。再用離心機離心(1 000 rpm，5 min)，保留上清液備用。取備用上清液裝入MD44透析袋中進行透析，透析的方法是用流動蒸餾水透析72 h。稱量透析后的液體體積為45 mL，加入無水乙醇55 mL使乙醇含量達到85%以上，然后放入4℃冰箱中靜止12 h，再次用離心機離心(1000 rpm，5 min)留沉淀備用。將所得的沉淀加入少量的無水乙醇(沒過沉淀即可)震蕩洗滌2次后，用相同的方法分別用丙酮、乙醚再各洗2次。最后將得到的沉淀放入電熱鼓風干燥箱干燥，直至呈粉末狀，即可得到純化的高掛草多糖[5]。

2.2 抑菌性試驗

2.2.1 菌懸液的配制 選取已經在斜面培養基活性良好的菌種，在無菌超凈工作臺上，用無菌接種環挑取少量菌種接種到裝有液體培養基的小三角瓶中(試驗時應在點燃酒精燈的無菌區內進行操作)，將接種好的液體培養基在恒溫培養箱中震蕩培養18 h左右。然后吸取1.0mL菌懸液用無菌生理鹽水稀釋10、102、103、104、105、106、107、108倍，再用血球計數板在顯微鏡下計算各稀釋液濃度[6]。最后選用105～106CFU·mL-1菌懸液備用。對于霉菌，將無菌生理鹽水倒入培養72 h左右的斜面接種試管中振蕩，再把液體倒入三角瓶中作為孢子懸液，然后吸取1.0 mL霉菌的孢子懸液，用無菌生理鹽水分別稀釋至10、102、103、104、105、106、107、108倍，然后用血球計數板法計算各菌懸液的濃度[7]，最后同樣選用濃度為105～106CFU·mL-1的孢子稀釋液備用。

2.2.2 抑菌圈的測定 采用濾紙片擴散法測定其抑菌性[8]，將提取純化的多糖溶于蒸餾水中，配制其濃度為5.00 mg·mL-1。取用直徑9 mm的圓形濾紙片置于5.00 mg·mL-1高掛草多糖浸泡并將其滅菌，在超凈工作臺中將0.1 mL各種菌懸液置于已經凝固的平板培養基上(細菌用LB培養基，真菌用PDA培養基)，用無菌的涂布器涂均勻。用鑷子夾取浸泡的濾紙片，在瀝去多余的糖液，將3個濾紙片按呈品字狀貼于平板培養基中。在恒溫培養箱中37℃靜止培養24 h后，用卡尺測定抑菌圈直徑。每種供試菌設三個平行組取其平均值。

2.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用二倍稀釋法[9]，將高掛草多糖母液稀釋成5.00 mg·mL-1、2.50 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.3125 mg·mL-1、0.1563 mg·mL-1、0.0781 mg·mL-1、0.0391 mg·mL-1、0.0195 mg·mL-1、0.0098 mg·mL-1、0.0049 mg·mL-1各種濃度的多糖溶液。用無菌的移液槍分別移取1.0 mL不同濃度稀釋液，與14.0 mL冷卻至45 ℃的瓊脂培養基混合均勻，置于無菌平皿中冷凝備用。再取1.0 mL的蒸餾水用同樣的方法作為對空白照組。然后用接種環分別蘸取各供試菌105～106CFU·mL-1菌懸液，接種于各平板的不同區域。

在恒溫培養箱中37 ℃培養24 h，以不長菌培養基的最低濃度作為各菌的最小抑菌濃度[10](霉菌28 ℃培養24 h)。

所謂的噴灌技術主要是通過專門設備把水通過壓力管道輸送到田間，然后噴射到空中，達到灌溉的目的。這種噴灌技術對于土壤和地形使用性強，但是容易受到風力的影響。

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 對DPPH·清除能力的測定 用移液槍分別取濃度0.2 mg·mL-1，0.4 mg·mL-1，0.6 mg·mL-1，0.8 mg·mL-1高掛草多糖溶液各2.0 mL于試管中，再分別加入4.0 mL0.1 μmol/L的DPPH溶液。在黑暗中放置20 min后，以85%乙醇溶液為空白，在517 nm處測吸光度值，做三次平行實驗取其平均值。再分別取濃度0.2 mg·mL-1，0.4 mg·mL-1，0.6 mg·mL-1，0.8 mg·mL-1高掛草多糖溶液各2.0 mL于試管，分別加入4.0 mL的85%乙醇溶液，在黑暗中放置20 min，以85%乙醇溶液為空白，在517 nm處測吸光度值，做三次平行試驗取其平均值。最后取4.0 mL 0.1 μmol/L的DPPH溶液加0.2 mL 85%乙醇溶液在相同條件下測吸光度值，做三次平行實驗取其平均值。

將測得的結果代入下式計算清除率(P)：

P(%)=(1-Ai-AjA0)×100%

公式1

式中A0為4.0 mL 0.1 μmol/L的DPPH溶液加0.2 mL 85%乙醇溶液所測吸光度的平均值；Ai分別為0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1高掛草多糖溶液加4.0 mL 0.1 μmol/L的DPPH溶液所測吸光度的平均值；Aj分別為0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1多糖溶液加4.0 mL85%乙醇溶液所測吸光度的平均值；P為清除率。

2.3.2 對O2-清除能力的測定 用移液管量取4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH=8.2)于4支試管中，置于25 ℃水浴鍋中預熱20 min，分別向4支加入1.0 mL濃度為0.2 mg·mL-1，0.4 mg·mL-1，0.6 mg·mL-1，0.8 mg·mL-1的高掛草多糖溶液和0.4 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，混合后在25 ℃水浴鍋中反應5 min，立即加入8 mmol·L-1HCl 1.0 mL終止反應后，于470 nm處測吸光度值，取1.0 mL蒸餾水用相同的方法做空白對照，做三次平行試驗取其平均值。再取一支試管加4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)于25 ℃水浴鍋中預熱20 min，加1.4 mL 25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液，混合后25 ℃水浴中反應5 min。立即加入8 mmol·L-1HCL 1.0 mL終止反應，于470 nm處測吸光度值。取用相同體積蒸餾水的方法做空白對照，做三次平行試驗取其平均值。

將測得的結果代入下式計算清除率(P)：

P(%)=(A0-AiA0)×100%

公式2

2.3.3 對·OH清除能力的測定 先取5支試管分別加入濃度為6 mmol·L-1Fe2+1.0 mL和6 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，再向5支試管中分別加入1.0 mL濃度為0.2 mg·mL-1，0.4 mg·mL-1，0.6 mg·mL-1，0.8 mg·mL-1的高掛草多糖溶液，加蒸餾水2.0 mL，再分別加入6 mmol·L-1H2O21.0 mL，10 min后以蒸餾流水為參比。在510 nm處測吸光度值，做三次平行試驗取其平均值。再向一支試管中分別加入濃度為6 mmol·L-1Fe2+1.0 mL和6 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，加蒸餾水2.0 mL，分別加入6 mmol·L-1H2O21.0 mL，10 min后以蒸餾流水為參比。在510 nm處測吸光度值，做三次平行試驗取平均值。

將所得結果代入下式計算清除率(P)：

P(%)=(A0-AiA0)×100%

公式3

式中A0為6 mmol·L-1Fe2+1 mL和6 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液和6 mmol·L-1H2O2溶液的吸光度平均值；Ai分別為0.2mg·mL-1，0.4 mg·mL-1，0.6 mg·mL-1，0.8 mg·mL-1的高掛草多糖溶液和6 mmol·L-1Fe2+1.0 mL和6 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液的吸光度平均值，P為清除率。

3 結果與討論

3.1 抑菌性試驗結果

3.1.1 抑菌圈結果 按2.2.2方法可得結果如表1所示。

表1 高掛草多糖溶液抑菌圈直徑(n=3)

由表1可知，在相同條件下，高掛草多糖對大腸桿菌、枯草桿菌抑制效果明顯，抑制效果基本相同；對酵母菌、對黑曲霉、根霉有一定的抑制作用。由此可知，在相同條件下，高掛草多糖對細菌的抑菌效果比真菌的抑菌效果好。

3.1.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結果 按2.2.3方法可得結果如表2所示。

表2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

注：“+”為平板長菌，“-”為平板未長菌

由表2可知，在相同的條件下，當高掛草多糖濃度為0.0 781 mg·mL-1時含有大腸桿菌的培養基中不長菌，所以高掛草對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.0 781 mg·mL-1；同樣在高掛草多糖濃度為0.1 563 mg·mL-1時含有枯草桿菌的培養基中不長菌，所以高掛草對枯草桿菌的最小抑菌濃度為0.1 563 mg·mL-1；當高掛草多糖濃度為0.625 mg·mL-1時含有酵母菌的培養基中不長菌，所以高掛草對酵母菌的最小抑菌濃度為0.625 mg·mL-1；當高掛草多糖濃度為2.50 mg·mL-1時含有根霉的培養基中不長菌，所以高掛草對根霉的最小抑菌濃度為2.50 mg·mL-1；當高掛草多糖濃度為5.00 mg·mL-1時含有黑曲霉的培養基中不長菌，所以高掛草對黑曲霉的最小抑菌濃度為5.00 mg·mL-1。該結果與高掛草多糖的抑菌圈測試結果相吻合。

3.2 抗氧化性試驗結果

3.2.1 對DPPH·清除能力的測定結果 按2.3.1的方法得到高掛草多糖對DPPH·清除能力結果如圖1所示。

圖1 高掛草多糖對DPPH·清除能力結果

由圖1可以看出，高掛草多糖對DPPH·的清除能力較好，在相同的條件下，不同濃度的高掛草多糖對DPPH·的清除能力不同；當高掛草多糖的濃度是0.2 mg·mL-1時清除率為12.51%，當多糖濃度達到0.8 mg·mL-1時清除率為19.84%。因此多糖對DPPH·有一定的清除能力，且隨著多糖濃度的增加對DPPH·的清除能力也增大。

3.2.2 對O2-清除能力的測定結果 按2.3.2中的方法可得到高掛草多糖對O2-清除能力結果如圖2所示。

圖2 高掛草多糖對O2-清除能力結果

由圖2可以看出，高掛草多糖對O2-的清除能力較好，在相同的條件下，不同濃度的多糖對O2-的清除能力不同；當高掛草多糖的濃度是0.2 mg·mL-1時清除率為12.41%，當多糖濃度達到0.8 mg·mL-1時清除率為23.36%。因此多糖對O2-有一定的清除能力，且隨著多糖濃度的增加對O2-的清除能力也增大。

3.2.3 對·OH清除能力的測定結果 按2.3.3中的方法可得到高掛草多糖對·OH清除能力結果如圖3所示。

圖3 高掛草多糖對·OH清除能力結果

由圖3可以看出，高掛草多糖對·OH的清除能力較好，在相同的條件下，不同濃度的多糖對·OH的清除能力不同；當高掛草多糖的濃度為0.2 mg·mL-1時清除率為13.59%，當高掛草多糖濃度是0.8mg·mL-1時清除率為21.51%。故高掛草多糖對·OH有一定的清除能力，且隨著高掛草多糖濃度的增加對·OH的清除能力也增大。

4 結 論

本文用熱水浸提法對高掛草中多糖進行提取，利用水提醇沉法純化高掛草多糖，并研究其抑菌性和抗氧化性。抑菌試驗中，高掛草多糖對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌有較好的抑制效果，對根霉、黑曲霉有一定的抑制作用；最小抑菌濃度(MIC)的測定試驗中，高掛草多糖對大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、根霉、黑曲霉的最低抑菌濃度分別為0.0 781 mg·mL-1、0.1 563 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、2.50 mg·mL-1、5.00 mg·mL-1，該結果與抑菌圈的測試結果相吻合?？寡趸囼炛懈邟觳荻嗵菍PPH·、O2-、·OH均有較好的清除能力，且清除率均隨著多糖濃度增大而增大。以上試驗結果表明：高掛草多糖具有較好的抑菌效果(細菌>酵母菌>霉菌)和明顯的抗氧化作用，具有很強的生物活性。我國高掛草分布廣泛、資源豐富，開發潛力巨大。本試驗能夠為高掛草資源的開發利用提供很好的理論基礎。