人乳低聚糖與嬰兒腸道健康

王祎，于景華

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

0 引 言

母乳被稱為營養的“黃金標準”，它可以促進嬰幼兒的生長發育并滿足健康所需。母乳中含有多種有益于人體健康的功能成分，其中人乳低聚糖（Human Milk Oligosaccharides，HMOs）的作用十分顯著[1]。各個國家的學者對HMOs的研究都有很長的歷史，對HMOs分離檢測方法的研究已有近90年[2]。人類的進化史，除了人類細胞和器官的進化，還有微生物菌群值得思考。每個人都可以視為由各種微生物定居的棲息地所組成的“島嶼”。這些數以億萬計的微生物主要存在于腸道中，形成了復雜的微生物群落，稱之為腸道菌群[3-4]。腸道菌群會參與影響人類健康的多種生理活動。本文主要闡述了HMOs對嬰兒腸道菌群的影響，希望對嬰幼兒配方奶粉的設計與發展有一定的實際應用價值。

1 人乳低聚糖的結構

HMOs的單體是D-葡萄糖（Glc），D-半乳糖（Gal），N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），L-巖藻糖（Fuc）和唾液酸[N-乙酰神經氨酸（NeuAc）]，其他哺乳動物的唾液酸中還包括N-羥乙酰神經氨酸[5]。到目前為止，已有至少120種人乳低聚糖的結構被確定，根據其核心結構，可把HMOs分為13類。此外，根據編碼巖藻糖基轉移酶的基因II型和III型，可將人乳分為四類：Se+/Le+，Se+/Le-，Se-/Le+，Se-/Le-[5]。

所有HMOs的還原末端都為乳糖，在酶的作用下，通過β-1,3或β-1,6糖苷鍵，連接N-乙酰葡糖胺殘基進行延伸。如果是以β-1,6鍵連接的，則HMOs可能為支鏈結構。在此三糖的基礎上，其非還原末端通過β-1,3或β-1,4糖苷鍵連接半乳糖，則構成了人乳低聚糖的核心結構。目前已經確定了超過15種的二糖結構。巖藻糖殘基可以通過α-1,2、α-1,3或α-1,4鍵，唾液酸殘基通過α-2,3或α-2,6鍵連接到核心結構，這構成了HMOs的多樣性[6]。

2 人乳低聚糖與牛乳低聚糖的比較

不同時期HMOs的質量濃度不同，人初乳低聚糖質量濃度為22～24 g/L，成熟乳中低聚糖質量濃度為10～15 g/L。作為比較，在母牛產后立即收集牛初乳，經檢測其中低聚糖質量濃度約1 g/L，在48 h后質量濃度迅速降低[7]。人乳內巖藻糖基化的低聚糖質量濃度高，唾液酸化的低聚糖僅約為10%～15%。牛乳則相反，唾液酸化低聚糖高達70%[8]。在牛乳中，少量的唾液酸化低聚糖含有半乳糖苷乳糖，這種結構在HMOs中是不存在的，中性低聚糖的數量要超過酸性低聚糖，目前已知的67種低聚糖中，有38種是中性的，29種是酸性的。巖藻糖基化低聚糖占HMOs的絕大部分。與此不同的是在牛乳中酸性低聚糖的含量要高于中性低聚糖，并且巖藻糖基化低聚糖濃度很低。牛初乳中含有多聚N-乙酰乳糖胺（LacNAc），LacdiNAc和GalNAc(1-4)Glc，但是在人乳或人初乳中并未檢測出。人乳與牛乳低聚糖的差異性可對乳產品研發起指導作用。

3 嬰兒腸道菌群

嬰兒身體上的細菌主要有五大類群：放線菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門。根據嬰兒腸道菌群的組成和優勢菌群的存在可將嬰兒腸道的核心菌群分為六組，第一組為鏈球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、Faecalibacterium菌屬；第二組為梭菌屬、毛螺旋菌科、Blautia菌屬；第三組為巴斯德氏目；第四組為艾?！ぶ举R菌屬；第五組為韋榮球菌屬；第六組為擬桿菌屬[9]。嬰兒的腸道菌群在從分娩到產后的過程中會有一定變化：變形菌門和放線菌門的兩類細菌在減少，厚壁菌門和擬桿菌門的兩類細菌有所增加[10]。

3.1 嬰兒腸道菌群的來源及影響因素

微生物會在新生兒出生后迅速在腸道中定殖，人乳驅動并調節菌群的結構和功能[10]。之前的研究表明，新生兒在分娩過程中能夠獲得母親陰道中的微生物，如乳桿菌屬。剖腹產嬰兒的口腔、皮膚和腸道多為葡萄球菌，鏈球菌或丙酸桿菌[11]。然而近幾年的研究發現，在胎兒早期，細菌可能通過兩種路徑進行定殖：血行性路徑和上行性路徑[10,12]。研究者推測血液流動可能將母體口腔內細菌傳遞給胎兒。胎兒所生活的子宮環境并非無菌，接近25%的早產兒是由于母親宮內感染和隱匿性微生物侵入羊膜腔造成的。在子宮內檢測到的細菌是常見的陰道寄生菌，這表明至少在早產時，子宮微生物群來自陰道感染。對于足月分娩的健康母親來說，胎盤[13]、臍帶[14]、羊水[15]中存在細菌。這些細菌通過體內的遞送方式定殖于胎兒腸道，這也是影響腸道菌群早期組成的重要因素。母親生產后的喂養方式（母乳或奶粉），母親的飲食，社會經濟地位，吸煙情況，抗生素的使用以及對微生物和早期免疫調節有深遠影響的其他環境因素，都會影響嬰兒的腸道菌群[16]。

3.2 人乳低聚糖對腸道菌群的影響

HMOs是一種益生元，可作為嬰兒腸道中有益菌的代謝底物，有益菌包括雙歧桿菌等（如Bifidobacterium bifidumJCM 1254,Bifidobacterium longum subsp.infantisJCM 1222,Bifidobacterium longum subsp.longumJCM 1217）[17]，可以幫助嬰兒塑造腸道菌群。HMOs可作為抑菌劑或者殺菌劑，還可抗病毒感染。HMOs不僅比現有的藥物安全，而且具有更廣泛的抗病毒保護機制，系統地發揮抗病毒活性。當HMOs作為人類的抗病毒藥物時，可以刺激上皮細胞的免疫反應和成熟[18]。當HMOs作為直接抗病毒藥物時，可以作為病毒的可溶性受體，通過模擬病毒受體的結構，阻斷對靶細胞的粘附，防止感染[19-20]。如今，HMOs的抗粘附性已成為研究熱點。Gordon團隊對兩組產后六個月產婦的HMOs進行分析，發現患有嚴重發育遲緩嬰兒的母乳中唾液酸化低聚糖缺乏。為了進一步研究其聯系性，研究人員以當地食物喂養小鼠作為對照組，食物中添加牛乳低聚糖為實驗組。在喂養接種了不成熟微生物菌群的小鼠后，發現小鼠發育明顯正常，除了肌肉量、骨質密度指標轉好之外，小鼠大腦發育、肝臟代謝都得到了積極改善。同時此團隊使用豬作為測試對象，并得到同樣結果。因此推測HMOs可對腸道菌群進行調節[21]。

很少有關于腸道菌群與HMOs體內消耗之間聯系的研究。De Leoz團隊以兩名健康母乳喂養嬰兒的糞便為樣本，通過DNA測序確定了細菌種類，并通過質譜確定了未被腸道細菌消耗的特定HMOs的豐富度。他們發現在嬰兒出生的幾周內，腸道菌群從非消耗HMOs逐漸轉變為消耗HMOs的菌群。在這個過程中腸桿菌科和葡萄球菌科在減少，類桿菌科與雙歧桿菌科的比例在增加[22]。Mei Wang團隊研究了HMOs與腸道菌群之間的聯系性，喂養母乳與喂養嬰幼兒配方食品的嬰兒腸道菌群組成不同，后者擬桿菌比例較高，梭菌屬XVIII、毛螺菌屬、鏈球菌、腸球菌等比例較低。兩種喂養方式的嬰兒腸道菌群都以雙歧桿菌為主。人乳中最豐富的HMOs為乳糖-N-四糖+乳糖-N-新四糖（22.6%）其次是2'-巖藻糖基化乳糖（14.5%）和乳糖-N-巖藻五糖I（9.5%）[23]。

3.2.1 壞死性小腸結腸炎

盡管在新生兒護理方面取得了很大的進步，但是壞死性小腸結腸炎（NEC）仍然是最常見且死亡率很高的腸道疾病之一[24]。超過四分之一的受感染嬰兒死于NEC，幸存的嬰兒常常面臨長期的神經系統并發癥[25]。與母乳喂養的嬰兒對比，喂養嬰幼兒配方食品的嬰兒患NEC的風險高達6-10倍[26]。體外研究表明，HMOs可能調節嬰兒免疫系統并減少腸粘膜中性粒細胞的滲透和活化。細菌的定殖和過度的中性粒細胞活性，是NEC發病機制的關鍵特征之一[27-28]。

2012年Jantscher-Krenn團隊鑒定出一種特殊的HMOs：二唾液酸化乳-N-四糖（DSLNT），它能有效的預防新生大鼠患NEC。實驗還發現與DSLNT結構密切相關，缺少一個或兩個唾液酸殘基的唾液酸乳糖-N-四糖(LSTb)和乳糖-N-四糖（LNT），沒有相同的效果，這表明DSLNT具有高度的結構特異性[29]。然而大鼠實驗具有明顯的局限性，因為它不能完全代表臨床結果，所以在進行臨床實驗前，必須仔細考慮由動物模型所得出的結果。為了彌補大鼠實驗和臨床研究之間的差距，Autran團隊進行了獨立的母嬰分組分析，他們發現，NEC患兒的母乳中，有一種特定的HMOs：DSLNT水平低于對照組。人乳DSLNT水平可能是鑒定NEC高?；純旱挠行飿酥疚?，補充DSLNT有望成為有效的預防方法[30]。DSNLT可以作為天然模板用于開發預防NEC的新型藥劑。并且Autran團隊也證明了Jantscher-Krenn團隊小鼠實驗的結論[31]。然而，驗證DSLNT降低NEC風險還需要大量的臨床研究。

之前的研究表明，脂多糖感受器Toll樣受體(TLR 4)在NEC疾病發展中具有重要作用。Yazji團隊推測內皮細胞中的TLR 4信號通過血管舒張分子內皮型一氧化氮合酶(eNOS)調節腸道吸收而對NEC起作用。團隊從小鼠內皮細胞選擇性地刪除TLR 4，結果顯示TLR 4的活性是NEC病情發展的關鍵之一[32]。HMOs中富含2'-巖藻糖基化乳糖（2'-FL）。Good團隊推測，2'-FL可以通過增強腸粘膜血流量來保護嬰兒預防NEC。進一步的實驗發現，TLR 4激活可以減少eNOS的mRNA在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)內的表達，但2'FL添加可以恢復eNOS的表達。Good團隊證明，2'-FL通過增加eNOS恢復腸道吸收，保護小腸黏膜結構。添加2'-FL的嬰幼兒配方食品可以通過eNOS調節新生兒腸道黏膜的血流量，用以防護NEC[33]。

3.2.2 B族鏈球菌

B族鏈球菌（GBS，又名無乳鏈球菌）是一種革蘭氏陽性細菌性病原體，其感染是引發嬰兒發病與死亡的主要原因[34]。在懷孕期間，GBS是胎膜感染（絨毛膜羊膜炎）的一個重要原因，可導致羊膜腔感染、早產、死胎、新生兒敗血癥。HMOs可選擇性刺激腸道中有益菌群（雙歧桿菌和乳桿菌）的增殖，間接抑制有害菌群生長，維持腸道微生態平衡[35]。

Andreas團隊通過咽和直腸拭子進行實驗樣本收集。探究HMOs對出生0～90天嬰兒GBS定殖的關系。證明了在含有乳糖-N-二巖藻黃素六糖或其它有相似分支結構HMOs的體內條件下，可以阻止GBS的增殖[34]。并且乳糖-N-二巖藻黃素六糖還可以促進腸道產生有益細菌，防止新生兒感染GBS。HMOs的組成受Lewis抗原系統影響，實驗表明Lewis血型陽性母親的嬰兒被GBS定殖的幾率更低。所以乳糖-N-二巖藻黃素六糖可以用作GBS治療的輔助手段。其他研究人員表示，在體外條件下GBS不能在含有某種特定HMOs的培養環境下增殖。某些非唾液酸化人乳低聚糖有抑制GBS增殖的作用。進一步的體外研究表明，GBS通過糖基轉移酶將HMOs結合到細胞膜上，阻止細菌增殖。這種機制與抗生素類似[36]。Ackerman團隊的最新研究，在GBS細胞培養液中添加HMOs，以觀察它對GBS生長和生物膜形成的影響。結果顯示，GBS的生長受到HMOs不同程度的抑制。其中抑制程度較弱一組的細菌生長曲線表明，在培養液中加入HMOs的最初8 h內，細菌的生長明顯減緩，且在最初4-6小時內，HMOs對細菌生長的抑制百分比接近23%，并在第7小時時降至14.4%。并且HMOs可明顯降低細菌生物膜/生物質的比率[37]。HMOs會對GBS的生物膜產生影響，從而起到阻止GBS的作用。HMOs中的乳糖-N-二巖藻黃素六糖可用作治療GBS的輔助手段。

Lin團隊發現HMOs具有新的性質，可直接抑制GBS而不依靠宿主的免疫。通過多維色譜法分離HMOs的不同組分，發現僅有特定的非唾液酸化人乳低聚糖具有抑菌性，并且可與多種常規抗生素協同作用。GBS轉座子插入文庫的表型篩選確定了GBS的一種編碼假定糖基轉移酶的特異性基因，這種基因賦予了對HMOs的抗性，表明HMOs可以作為替代底物，損壞鏈球菌的生長動力學，從而破壞GBS組成。此研究揭示了HMOs的一種獨特抗菌作用[38]。

3.2.3 雙歧桿菌

在研究的眾多微生物中，雙歧桿菌可以綜合利用HMOs。母乳中低聚糖可以增強嬰兒腸道中雙歧桿菌的優勢作用。Garrido團隊從嬰兒腸道中篩選了長雙歧桿菌亞種與兩歧雙歧桿菌。通過轉錄組測序技術比較了兩種菌代表性植株的全部轉錄組。團隊發現雖然雙歧桿菌都可以將HMOs用做唯一碳源，但是利用的模式不同。嬰兒雙歧桿菌對特定HMOs底物的利用能力基本相同，而兩歧雙歧桿菌更具多樣化。根據兩歧雙歧桿菌SC555和嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697的轉錄組顯示，兩種菌株共同利用的HMOs結構與中性HMOs相似，但后者的一些菌株不能在巖藻糖基化或唾液酸化的HMOs上生長[39]。

Asakuma團隊研究表明，在HMOs為碳源的條件下，B.longum subsp.infantisJCM 1222增殖快，且在10小時內，細胞密度達最大值。B.bifidumJCM 1254在前期顯示出增殖，但在15小時后進入靜止期。相反B.longum subsp.longumJCM 1217和B.breveJCM 1192并沒有明顯增殖[40]。Garrido團隊研究證明，嬰兒腸道菌群通常定殖了兩種長雙歧桿菌的兩個亞種：B.infantis和B.longum。所有B.longum菌株均可有效利用乳糖-N-四糖，某些菌株可利用巖藻糖基化人乳低聚糖。其中B.longumSC596能夠在HMOs條件下很好地生長，因為含有一種新的基因簇，所以可以優先利用巖藻糖基化人乳低聚糖[41]。

嬰兒雙歧桿菌可以降低腸黏膜道通透性。在小鼠中定殖人類排泄物中的微生物，可發現增加雙歧桿菌的數量可減少細菌易位的現象。HMOs激活嬰兒雙歧桿菌中的多種基因，使其能夠在腸道菌群中占據主導位置，通過加速免疫反應的成熟，抑制炎癥，改善腸道通透性和增加乙酸鹽的產生，從而有利于嬰兒的健康。還有大量研究證明，許多雙歧桿菌編碼細胞表面的胞外多糖（EPS），細胞表面長有稱作菌毛的蛋白質附屬物，或者在細胞表面會分泌一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，所有這些都可能在腸道中產生作用[12]。

3.2.4 腹瀉

HMOs中富含大量2'-FL，它可以抑制空腸彎曲桿菌和杯狀病毒增殖以及阻止大腸桿菌所產生的熱穩定性腸毒素與宿主細胞配體結合。之前的研究表明2'-FL可降低大腸桿菌毒素導致的感染。Morrow團隊選擇93名剛出生且接受母乳喂養的嬰兒作為實驗對象，跟蹤調查兩年。每周收集嬰兒的喂養情況與腹瀉數據并且分析產后1-5周母乳樣本中低聚糖含量。結果可知，母乳中2'-FL含量高時，中度至重度腹瀉的發生率較低。2'-FL可以降低彎曲桿菌和杯狀病毒所引起的腹瀉率以及嬰兒腹瀉發病率[42]。

諾如病毒，又稱諾瓦克病毒，是急性胃腸炎的主要病原體之一。根據VP1衣殼基因的不同可將其分為六個基因組GI-GVI，其中GI和GII是導致人類感染的主要基因組。諾如病毒感染的關鍵是其與組織血型抗原(HBGAs)之間的相互作用[43]。HBGAs主要分布在腸道、呼吸道上皮細胞，在人類分泌物中也有發現。實驗發現諾如病毒還會與HMOs相互作用，HMOs具有與構成HBGAs結構相似的單糖組成，可以模擬HBGs，作為一種受體誘餌，與病毒結合[22]。Koromyslova團隊研究發現HMOs不僅可以模擬HBGAs與GII.10諾如病毒結合，還可以與其他基因組的諾如病毒結合。團隊通過X射線晶體學確定了GII.17變體的HBGA結合口袋，并且實驗發現GII.17諾如病毒與GII.4具有相同對的P區結構殘基。HMOs中2'-FL可阻止GI.1和GII.17病毒粒子病毒與HBGAs結合[44]。還需要對3'-巖藻糖基化乳糖與3'-巖藻糖基化低聚糖進一步研究，因為通過X射線晶體學和串聯質譜研究發現它們會識別HBGA的結合位點并與之結合[45]。鑒于HMOs對諾如病毒的抵抗作用，可將其添加到嬰幼兒配方食品中模擬人乳。

輪狀病毒是呼腸弧病毒科的無包膜雙鏈核糖核酸病毒。病毒粒子最外層的結構蛋白是VP4和VP7，前者是糖蛋白，主要參與病毒粒子組裝，后者形成病毒表面的突出，負責病毒的附著與侵入宿主細胞[46]。輪狀病毒感染是嬰兒腸胃炎和腹瀉的主要原因，占五歲以下嬰兒死亡總數的5%。

Hester團隊發現唾液酸化低聚糖能后在體外抑制輪狀病毒對宿主細胞的侵染，并且在小豬模型中發現中性和酸性HMOs能夠減少輪狀病毒的復制[47]。Li團隊的實驗表明，HMOs可以抑制輪狀病毒的結合或者復制，增強黏膜上Th1/Th2細胞因子應答和組成調節，從而提高腸道代謝潛能。相反，益生元scGOS/lcFOS混合物僅促進機體對感染的全身性抗體應答。因此添加HMOs的嬰幼兒配方食品可以用來防止輪狀病毒感染[48]。

4 結 論

嬰幼兒時期是身體和智力發育的關鍵期。母乳能滿足嬰兒的營養需求，作為嬰兒最安全、最天然的食物，含有嬰幼兒配方奶粉所沒有的免疫蛋白和生長因子。由于嬰幼兒配方奶粉的目的是模擬母乳，因此其中所添加各種成分的種類與含量應以母乳為標準。

HMOs可以促進雙歧桿菌的增殖，并且可以與B族鏈球菌細胞膜結合從而抑制其生長甚至間接破壞細菌的形成。HMOs中的2'-FL會增加eNOS表達，恢復腸道吸收，保護小腸黏膜結構，預防NEC。HMOs還可以抑制病毒感染，降低腹瀉率，促進免疫發育。添加有HMOs嬰幼兒配方奶粉的研發與普及已經成為奶粉研究設計的大趨勢。