代謝組學在乳酸菌研究中的應用

楊 慧，步雨珊，易華西

中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266000

代謝組學(metabolomics)是 “組學”科學中的一個新興領域，也稱為代謝物組分析或代謝譜分析[1]，涉及到某一生物或細胞在特定時期里的所有低分子量代謝物(<1 500 Da)的定性定量分析[2]，這些代謝物包括內源性和外源性小分子化合物，例如肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、有機酸、維生素、多酚，生物堿和礦物質等。代謝組學最初應用于植物科學和毒理學領域[3]，近年來也逐漸成為現代食品科學研究的重要工具[4]，特別是解決與食品安全、質量和營養相關的問題[4-7]。隨著代謝組學在食品科學中應用的逐漸深入，在乳酸菌發酵過程和功能研究中應用代謝組學也成為一個引人關注的課題[8]。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一種工業價值極高的兼性厭氧菌，在食品工業中廣泛用于發酵乳、肉制品、果蔬加工等，某些物種的乳酸菌可以產生抗微生物劑以用于食品的保藏[9]，另外還可用于治療腸道疾病、作為疫苗抗原的傳送載體等[10]。代謝組學可能成為乳酸菌相關研究的一個有效工具，目前已經在乳酸菌發酵代謝產物、代謝通路與調控以及乳酸菌對人和動物腸道作用的評估等研究方向有了新的進展。本文綜述了代謝組學的研究技術及其在乳酸菌領域的應用，并探討了目前存在的問題及發展前景。

1 代謝組學分析技術

代謝組學分析通常被分類為靶向(特異性)或非靶向性(非選擇性或整體性)分析。靶向分析更專注于一組特定代謝物的鑒定和定量，對于評估某些條件下樣品中特定化合物組的作用非常重要，通常需要更高水平的代謝物提取和純化。相比之下，非靶向分析專注于檢測盡可能多的代謝物組，以獲得模式或指紋，而無需識別或量化特定的化合物[4]。代謝組學旨在將通過一系列最新技術發現收集的信息整合到代謝物分離，檢測，鑒定和定量中，其關鍵步驟是代謝物的分離和檢測[1]。

1.1 代謝組學分離技術

代謝組學最常用的分離技術是液相色譜(LC)及其高性能(HPLC)或超高性能(UPLC)形式，氣相色譜(GC)和毛細管電泳(CE)[11]。高效液相色譜(HPLC)具有高效、高速和高靈敏度的特點，在食品藥品安全檢測和質量評價中應用廣泛[12]。超高效液相色譜(UPLC)的引入實現了液相色譜的最新技術進步，與HPLC相比，UPLC技術提供更高的峰容量，更高的分辨率，更高的靈敏度和更高的速度，這種方法可以獲得與HPLC相似的結果，但運行時間要短得多，可以減少10倍[13]。UPLC的主要研究領域是藥物分析和生物分析，也可應用于食品分析中，如測定食品成分，食品添加劑和有害化合物等[14,15]。氣相色譜(GC)更側重于揮發性代謝物的檢測，分離速度快，所需樣品量較少[16]。毛細管電泳(CE)以毛細管為分離通道，可以分離和分析納升數量級的樣品，雖然其制備能力差、分離重現性差等劣勢，但是它最吸引人的特點是所需有機溶劑和試劑非常少(幾納升)，特別適用于體積受限的樣品[17]。CE可以分離各種分析物，從小的無機離子到大的蛋白質甚至是完整的細菌均可分離[18]。

1.2 代謝組學檢測技術

在檢測技術中，最常用的是核磁共振(NMR)，質譜(MS)和近紅外光譜(NIR)。NMR是代謝物指紋識別和分析研究中最常用的分析工具之一，其樣品前處理簡單且不會破壞組分，成本低，然而，它的主要缺點是靈敏度差和樣品需求量大。相反，MS具有高靈敏度和選擇性， 最大的優點是它可以對各種分子進行綜合評估。MS分析系統最常見的是直接輸注質譜(DIMS)，基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS)和解吸電噴霧電離(DESI)[19]。最近，選擇性離子流管質譜(SIFT-MS)已被引入食品分析[20]。在20世紀90年代早期，紅外光譜(IR)被引入作為表征和鑒定微生物的工具[21]。傅里葉變換在紅外光譜中的應用促進了傅里葉轉換紅外光譜(FTIR)技術的發展，該技術被迅速引入代謝組學程序組。后來，FTIR被作為用于快速和非破壞性地分析大量不同產品的質量和成分的代謝組學指紋工具[22]。

1.3 代謝組學聯用技術

目前，代謝組學中使用的主要分析技術是聯用技術，例如GC，HPLC和CE與MS偶聯(分別為GC-MS，HPLC-MS和CE-MS)。GC-MS提供高分辨率和可重復性，通過GC-MS制備代謝指紋的創新技術已經開發出來[23]。HPLC-MS是代謝組分析中最常用的聯用方法，與GC-MS和CE-MS相比具有更高靈敏度，是非靶向代謝組分析的有用工具[24]。NMR，FTIR和DIMS因其高性能和最少的樣品制備，已經用于代謝指紋識別，這歸功于它們的高性能和最少的樣品制備。然而，NMR和FTIR的檢測限高于基于MS的技術，其應用范圍僅限于那些以高濃度存在的代謝物[25]。

總之，沒有一種單獨的方法能夠檢測樣品的所有代謝物，因此需要不同技術的組合以確保獲得的結果是全面的。因此，在代謝組學中通常優選聯用技術，使鑒定盡可能多的代謝物令其結果接近整個代謝組成為可能。

2 代謝組學在乳酸菌領域的應用

近幾年，代謝組學在乳酸菌研究領域取得了很大進展和突破，比如乳酸菌的區分和鑒定，發酵工程以及腸道健康等方面。

2.1 通過代謝指紋區分和鑒定乳酸菌

由于生產實踐的需要，人們要求鑒別及了解乳酸菌的特性，另外有些乳酸菌可能是人類或其他動物的致病菌，在生產利用中，可能會出現“敵我不分、認敵為友”的情況，因此這類乳酸菌的鑒定也至關重要。傳統的乳酸菌分類鑒定方法多采用形態學觀察和生化實驗的表型分類法，但是傳統方法很容易受到生長條件的影響，結果模糊或難以解釋，乳酸菌的遺傳本質很難反映[26]。隨著遺傳學和分子生物學等學科的發展，全基因組測序、DNA 雜交、16SrRNA 基因測序以及聚合酶鏈式反應(PCR)技術等方法在乳酸菌分類上得到了廣泛的應用，然而并不是所有菌株的基因型與表型都一致，分類結果可能會不同，并且技術價格相對昂貴，耗時費力，不適合常規鑒定[27]。

尋找一種快速、有效的乳酸菌鑒別方法成為人們研究的熱點，因此代謝譜分析方法(metabolic profiling)應運而生。代謝組學能夠使用高通量分析方法(例如核磁共振光譜法)分析不同的生物系統，該方法能夠對細胞代謝物進行有效和靈敏的鑒定，然后通過多元統計方法來鑒定受實驗變量顯著影響的代謝物[28]。Gallegos等[29]利用氣相色譜離子遷移譜聯用技術(GC-IMS)檢測乳酸菌中的揮發性代謝物，結合多變量分析技術(PCA)，對四種乳酸菌進行區分，該技術成本低，具有即時檢測的優勢，無需樣品預處理或進行復雜的采樣。Tomita 等[30]利用基于核磁共振的代謝組學技術來區分乳酸菌的菌株依賴性發酵特性，并成功地區分了測試菌株的發酵特征，提供了可能影響發酵食品味道、香氣、功能特性的特征代謝物的進一步信息，表明基于NMR的代謝組學鑒別可以作為一種用于從大樣本集中篩選單個實驗室菌株的快速、高通量的技術，并指示某個菌株及其代謝物可能對發酵食品質量產生的潛在影響。Yang 等[31]利用基于液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀(LC-QQQ-MS)的靶向代謝組學技術結合非靶向代謝組學技術來區分四種乳酸桿菌(嗜酸乳桿菌，發酵乳桿菌，羅伊氏乳桿菌和德氏乳桿菌)，多元統計結果表明，這四種乳酸桿菌在相同的營養環境中培養時顯示出獨特的代謝指紋，可以明顯區分，表明代謝組學方法在快速鑒別人類健康相關細菌菌株方面具有巨大潛力。

盡管代謝組學顯示出快速鑒別乳酸菌菌株的潛力，但其與傳統乳酸菌鑒定方法和基因型技術不同，在乳酸菌分類學研究中未得到太多的驗證和鞏固，尚未得到充分探索，迄今為止關于代謝組學方法在乳酸菌鑒定和分型中的應用的信息很少[32]。因為代謝組學的檢測對象僅限于代謝物，無法深入到基因、蛋白層面，在某些乳酸菌的鑒定上確實存在很多局限，但代謝組學與傳統鑒別方法、基因型技術和蛋白組學的組合有待成為乳酸菌分類鑒定的更全面更準確的方法，如Foschi等[32]將基于16S rRNA的傳統基因型方法、基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)的蛋白質組學方法及基于質子核磁共振(1H-NMR)的代謝組學方法在乳酸菌分類和代謝表征方面進行了比較和結合，發現三種方法各有優勢，代謝組學方法的優勢在于可以將乳酸桿菌生物活性與分類學相關聯，操作簡單快速，成本低，三種方法的組合可以更全面地展示乳酸菌分類鑒定結果。然而，如何利用多組學方法更準確地實現乳酸菌的分類和鑒定，有待進一步探索。

2.2 乳酸菌發酵條件監測及工藝調整

乳酸菌在發酵過程中會有糖類、氨基酸、揮發性的醇、酮、有機酸、脂肪酸和抑菌物質等大量代謝物生成，根據代謝產物的變化可以為發酵的監控和優化提出指導意見，因此乳酸菌代謝產物的監測極為重要[33]。代謝組學技術是一種高通量的快速檢測方法，近年來，它已經被廣泛地應用于乳酸菌發酵過程中代謝物組分和菌落變化的監測、指導調控和預測發酵過程中的代謝物組分變化以及最終產品的感官和營養品質的評定和調節[1]。

Piras等[34]利用1H NMR代謝組學技術結合物理化學方法和微生物學特征來研究原料乳酪的成熟過程，發現1H NMR與化學計量學相結合是奶酪代謝物指紋識別的有效工具，這些發現奠定了根據原產地保護(protected designation of origin，PDO)規范生產的Fiore Sardo干酪認證的代謝基礎，可用于評估奶酪制造過程中的發酵過程，此外，結果表明可以進一步開發NMR代謝組學以評估Fiore Sardo干酪的真實性，特別是其對PDO規范的符合性。Settachaimongkon 等[35]利用頂空固相微萃取一氣質聯用技術(SPME-GC / MS)和1H-NMR的代謝組學方法結合多元分析來研究在亞致死應激條件下預培養兩種商業益生菌菌株(LactobacillusrhamnosusGG和Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBB12)對其在酸奶中的存活和代謝物形成的影響，結果表明，這兩種菌株對亞致死鹽和低pH脅迫條件的適應性反應不僅影響它們在酸奶生產期間的存活，而且還導致發酵代謝物組成的顯著變化，該研究提供了關于在實際食物載體中應用適應性益生菌的新信息。Ferri等[36]利用代謝組學方法選擇最佳的面粉-微生物菌種組合來改善谷物發酵食品的感官和功能特性，這是首例使用代謝組學方法將特定的揮發性分子組與發酵谷物中的抗氧化活性和多酚含量相關聯，表明代謝組學可能是快速選擇菌株/底物組合以同時增加風味和健康的重要工具。Zhao等[37]利用基于GC-MS的多標記分析篩選泡菜鹽水的揮發性有機化合物，監測這些標記物在整個發酵過程中的變化，篩選出13種化合物作為泡菜鹽水的判別性揮發性標記物，能良好地用于促進乳酸菌起子培養物的篩選和發酵優化，以生產更好感官品質的泡菜相關食物。Seo等[38]利用GC-MS結合多元統計分析研究泡菜在發酵過程中的代謝變化以及添加不同鹽濃度(0%、1.25%、2.5%和5%)的泡菜的代謝差異，結果顯示早期發酵速度和代謝物根據鹽度不同而變化，其中5%鹽度的泡菜具有更多的細菌多樣性，結果表明了基于GC-MS的代謝組學在評估具有不同鹽度的泡菜的發酵特性方面的適用性。Zhao等[39]利用基于GC-MS的代謝組學研究副干酪乳桿菌 HD1.7(LactobacillusparacaseiHD 1.7)作為起子對大白菜發酵過程中細菌群落和代謝組特征的影響，結果表明與自然發酵相比，接種了副干酪乳桿菌的大白菜具有更短的發酵過程，更少的病原體和更豐富的風味，同時也顯示副干酪乳桿菌HD1.7是其他蔬菜發酵過程中的理想起子。

此外，在乳酸菌發酵調控方面，代謝組學與其他組學的結合逐漸成為研究熱點。Cretenet等[40]結合代謝組學、轉錄組學以及耗氧動力學，對乳酸乳球菌對奶酪生產過程中遇到的初始氧化應激的適應性提出了新的見解，發現在最初高水平的氧存在下，乳酸乳球菌顯示出對氧化應激的早期和過渡性適應，這使細胞用于工業時能夠維持非常重要的關鍵性狀，例如快速酸化和降低生長培養基的氧化還原電位。Park等[41]將代謝組學和宏基因組學結合，研究了泡菜在發酵期間的代謝物和微生物群落的動態變化，確定了利用優勢微生物和發酵液縮短泡菜發酵期的可能性。Liang等[42]聯合利用代謝組學和蛋白組學綜合研究了德氏乳桿菌對各種發酵條件的響應，揭示了顯著相關的代謝模塊、中樞代謝物以及差異蛋白表達譜，為進一步改善乳酸菌合成生產D-乳酸提供理論指導。代謝組學和其他技術的聯用可以涵蓋乳酸菌代謝差異、基因表達或蛋白差異的多尺度分析，快速獲取大量數據。

2.3 腸道益生菌功能評價

人體腸道內含有各種微生物，它們彼此相互作用以產生新的代謝物。益生菌可以與宿主的腸道微生物相互作用，以誘導有益于健康的微生物群組成的變化[43]，通常用作治療腸道感染、腸道炎癥和腸道過敏等疾病[44]。然而，個體之間腸道微生物顯著不同，并且它們產生的代謝物譜多變。因此，應以全面的角度評估益生菌，腸道微生物和代謝物之間的關系。近年來，運用各大組學技術探索益生菌對腸道的影響已成為了研究的熱點。其中，代謝組學能夠檢測到益生菌作用下腸道代謝物的變化，更全面地解釋乳酸菌代謝物對細胞因子表達的影響[45]。

Chorell等[46]研究了食用益生菌后嬰兒的血脂特征和代謝反應，將副干酪乳桿菌LF19(Lactobacillusparacaseissp.paracaseiF19 )添加到提供給健康嬰兒的谷物餐中，然后進行氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF-MS)分析以鑒定確定嬰兒斷奶期間食用益生菌對代謝產物的影響，在LF19處理的嬰兒中，棕櫚油酸(與內臟肥胖有關)的水平降低，腐胺(與腸道完整性有關)的水平增加。Shi等[47]利用二維氣相色譜飛行時間質譜(GC×GC-TOF MS)結合化學計量學數據分析，鑒定用或不用酒精喂養的小鼠中受益生菌顯著影響的代謝物，結果表明，鼠李糖乳桿菌可以通過增加腸道脂肪酸、減少肝臟脂肪酸和增加氨基酸濃度的機制來減輕酒精誘導的脂肪肝。Abdulkadir等[48]對攝入益生菌的嬰兒患者的不同時期的糞便進行基因測序和代謝組學分析，發現益生菌物種成功地定殖早產腸道，減少潛在致病細菌的相對豐度，并影響腸道功能，表明治療性施用的益生菌可能繼續對嬰兒早期的腸道微生物群落發揮重要的作用。Noorbakhsh等[49]在合生元(即益生菌加益生元)酸奶干預4周后，對16名健康人和8名腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)患者的尿液和血清代謝物進行了基于HNMR的代謝組學研究，結果顯示IBS引起一碳代謝的轉變，這些改變可以通過合生元干預來逆轉，在干預反應中也觀察到糞便中乳桿菌數量的增加和IBS-D患者健康狀況的改善。Mengxia等[50]通過1H-NMR光譜結合多變量分析對補充了益生菌的斷奶大鼠的尿液和糞便代謝特征進行了分析，找出潛在的生物標志物和相關的代謝途徑，研究發現補充嗜酸乳桿菌 NCFM(LactobacillusacidophilusNCFM)和乳雙歧桿菌 Bi-07(BifidobacteriumlactisBi-07)有助于促進斷奶大鼠腸道微生物組的結構和功能成熟。Vemuri等[51]利用GC-MS的代謝組學結合基因測序技術來研究嗜酸乳桿菌DDS-1(LactobacillusacidophilusDDS-1)是否可以在腸道微生物受年齡影響而變化的條件下調節年輕和衰老的小鼠的宿主代謝表型，結果顯示嗜酸乳桿菌 DDS-1增加了有益菌的相對豐度，并降低機會性細菌如變形桿菌的相對水平，表明DDS-1對腸道微生物群的調節導致衰老小鼠代謝表型的改善，該研究突出了益生菌在確定和調節健康老化腸道中代謝特征中的關鍵作用，可以用作識別年輕人和老年人群中特定促進健康的代謝途徑的參考。

綜上所述，代謝組學是研究益生菌影響宿主健康狀況的有效工具，能夠很好地檢測在益生菌作用下宿主微生物群的代謝反應。相對于基因組學、轉錄組學、蛋白組學，代謝組學在腸道益生方面的研究較少，還未充分挖掘。代謝組學與其他組學的整合應用將加速益生菌的更深入研究與開發。

3 問題與展望

目前代謝組學在乳酸菌研究領域中的應用主要集中在以下幾個有方面： (1)在乳酸菌的分類和鑒定方面，采用靶向或非靶向技術結合多元統計分析，可以根據菌株獨特的代謝指紋進行菌株篩選和鑒定，雖然沒有得到太多的驗證和鞏固，但代謝組學因其檢測方法的高效、高通量，在菌株篩選和鑒定方面有很大的發展潛力，有待進一步挖掘。(2)在乳酸菌發酵過程監測及工藝優化方面，應用最為廣泛，常用于發酵乳制品、泡菜、發酵豆制品等食品加工過程中的監控與優化，便于人們掌握乳酸菌生理生化規律，為發酵工藝的調控和優化指明方向。(3)在腸道益生菌功能評價方面，代謝組學能夠對乳酸菌作用下宿主微生物群的代謝進行高通量的檢測，識別關鍵代謝途徑或關鍵代謝物，為探索調控機制提供參考。

代謝組學作為一個新興學科，也存在一些問題亟待解決。首先，因為代謝物的變化性和不穩定性，代謝組學分析對樣本的數量和質量要求很高，因此樣本采集相當重要，而目前樣本的采集和處理仍處于探索階段，很難建立一個統一的標準；其次，代謝組學數據復雜多樣，如何從大量數據中提取所需信息是當前面臨的一大挑戰[52]。另外，尋找代謝物中獨特的生物標志物是研究熱點，但尋找標志物并不是代謝組學研究的終極目標，深入挖掘其作用機理，解釋生物標志物與乳酸菌發酵、益生作用等之間的關系是研究熱點，也是難點。代謝組學雖然已經能在一定程度上進行生物學解釋，但是在檢測過程中很容易受到背景干擾，有時無法完整解釋生物學過程，因此需要與其他組學的結合，以獲得更全面的結果。代謝組學與其他技術(轉錄組學、蛋白組學、分子技術等)結合以進行多層次、多角度的生物學解釋，是乳酸菌代謝組學分析技術發展的方向，隨著其自身的完善與發展，代謝組學在乳酸菌研究領域有望發揮更大的作用。