循環腫瘤DNA中ESR1突變在激素受體陽性晚期乳腺癌內分泌治療中的價值研究△

劉斌亮，馬飛#，陳閃閃，易宗畢，管秀雯，黎立喜，曾益新

1國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院腫瘤內科，北京100021

2中國醫學科學院北京協和醫學院，北京100021

乳腺癌是全世界范圍內最常見的女性惡性腫瘤，70%的患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性，內分泌治療是該部分患者重要的治療方法之一[1-2]。雖然絕大多數ER陽性的患者可以從內分泌治療中獲益，但是，患者在治療過程中會不可避免地產生內分泌治療的耐藥[3]。編碼ERα的基因——雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）基因異常是導致內分泌治療耐藥最常見的原因[4]。ESR1突變將引起ER活性的提高和ER表達的上調，甚至可以產生不依賴雌激素的自發活性[3,5]。對于采用多線內分泌治療，尤其是既往使用芳香化酶抑制藥（aromatase inhibitor，AI）后發生疾病進展的患者，ESR1突變率明顯上升[5-6]。接受內分泌治療后，15%～30%的乳腺癌患者會出現ESR1配體結合區域（ligand binding domain，LBD）的突變，其中，以D538G及Y537S位點突變最為常見。有研究證實，ESR1突變將縮短后續AI類藥物的無進展生存期（progression free survival，PFS），產生內分泌治療耐藥[7]。氟維司群是一種新型ER拮抗劑，對于使用AI后出現耐藥或者進展的患者有效。多個研究證明，ESR1突變的患者對氟維司群相對敏感，氟維司群的療效優于AI[5,8-9]。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）常攜帶腫瘤相關的單核苷酸變異、拷貝數改變及結構變異等遺傳學改變，這一特點促使ctDNA成為潛在的生物標志物[10]。微滴式數字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術可以檢測到≥0.001%的任何基因突變，是目前ctDNA中檢測ESR1突變的最常用方法[6,11]。雖然ESR1突變在內分泌治療耐藥中的作用已得到廣泛的研究，但是ESR1的檢測在臨床中尚未得到足夠的重視。目前，尚無中國人群ESR1突變情況的報道，對于ESR1突變患者的后續治療尚無一致性結論。因此，本研究利用ddPCR技術檢測ctDNA中ESR1的突變情況，旨在探索ESR1突變在乳腺癌內分泌治療中的具體影響，為晚期乳腺癌的治療提供策略和參考依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月至2017年12月中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院收治的53例激素受體陽性的晚期乳腺癌患者作為研究對象。納入標準：①女性，年齡≥18歲；②均經病理檢查確診為乳腺癌；③穿刺或手術切除標本免疫組織化學染色結果為激素受體陽性；④有可測量病灶；⑤臨床分期均為Ⅳ期；⑥主要器官功能正常。排除標準：①懷孕期、哺乳期婦女；②合并外周神經系統障礙或有明顯精神障礙及中樞神經系統障礙史；③合并嚴重的心血管疾病、肝?。ㄈ绺斡不龋?、呼吸系統疾病、腎臟疾病或不能控制的糖尿病或高脂血癥。53例患者的年齡為31～79歲，平均年齡為（52.7±11.4）歲；原發灶位置：左側29例，右側24例；手術方式：保乳手術8例，根治性切除術32例，術式不詳3例，無法手術10例（初治晚期患者）。53例患者中，10例患者為初治Ⅳ期患者，診斷時即已發生轉移，其余43例患者為復發轉移的患者。入組患者中，除了2例患者未行術后輔助內分泌治療以及1例患者于術后放療中即出現復發，轉入晚期治療外，其余患者均給予標準的輔助放化療和內分泌治療?；颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐椴⒑炇鹬橥鈺?，本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 ddPCR檢測ctDNA中的ESR1突變

1.2.1 樣本采集 于內分泌治療前抽取患者的肘正中靜脈血10 ml于EDTA抗凝管中，采集2 h內需進行離心處理。全血標本在4℃的溫度下離心10 min，離心速度為4143 r/min，離心半徑為12 cm。離心后分離上層血漿，并在4℃的溫度下離心10 min，離心速度為12 023 r/min，離心半徑為12 cm。去除殘余的細胞及細胞碎片；血漿和相應的血細胞標本置于-80℃的冰箱中保存待測。嚴格按照Mag-MAX?Cell-Free DNA Isolation Ki（t購自美國Applied Biosystems公司）說明書步驟提取血清游離DNA，提取的游離DNA樣本保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 特異性引物探針設計 根據人ESR1基因序列，采用Beacon DesignerTM8.12軟件設計檢測ESR1基因Y537S和D538G位點的序列特異性寡核苷酸引物和探針[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。（表1、表2）

表1 人ESR1基因Y537S位點ddPCR特異性寡核苷酸引物探針

表2 人ESR1基因D538G位點ddPCR特異性寡核苷酸引物探針

1.2.3 數字PCR檢測游離DNA中的ESR1突變QuantStudio?3D數字PCR系統采用高密度納升微流控芯片，結合特異性引物和Taqman探針技術，以FAM（藍色熒光）和VIC（綠色熒光）分別標記識別突變型DNA和非突變型DNA的探針，將樣本分到20 000個單獨反應孔中，單獨進行PCR擴增，從而實現“單分子模板PCR擴增”；擴增結束后，通過對呈現兩種信號類型的反應孔比例和數目進行統計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數，從而實現對樣本突變的分析。ESR1突變豐度≥0.01%定義為ESR1突變。按照QuantStudio?3D數字PCR系統標準流程進行操作。反應體系：7.5 μl QuantStudio? 3D digital PCR Master Mix v2；1.2 μl 10 μmol/L上游和下游引物；0.3 μl 10 μmol/L野生型和突變型探針；20 ng模板（ctDNA樣本）；去離子水補足15 μl終體積。反應條件：96℃10 min 1個循環；57℃2 min，98 ℃ 30 s，共39個循環；57℃ 2 min，1個循環，最終將溫度降至10℃進行保存。

1.3 ESR1突變與內分泌治療效果的關系

為了評估ctDNA檢測ESR1對療效評價的時效性，同時記錄患者影像學或腫瘤標志物水平以評估腫瘤進展的時間，兩者之差即為ctDNA提前發現腫瘤進展的時間。

根據實體瘤療效評價標準1.1版[12]，每2～3個月對患者的臨床療效評估1次。原發性內分泌治療耐藥指的是患者術后輔助內分泌治療2年內出現復發轉移，或轉移性乳腺癌經內分泌治療6個月內出現疾病進展。繼發性內分泌治療耐藥指的是術后輔助內分泌治療2年后出現復發轉移，或于完成輔助內分泌治療后12個月內出現復發轉移，或轉移性乳腺癌經內分泌治療超過6個月出現疾病進展[11]。PFS指從治療開始至疾病進展或死亡的時間。未達到疾病進展或死亡的患者，計算其末次隨訪時間。在本研究中，若ESR1檢測時患者處于內分泌治療中，則記錄該內分泌治療的PFS；若檢測時患者處于化療中，則選取檢測時間后1年內最近的一次內分泌治療的PFS。為了探索應用氟維司群的最佳時機，本研究根據內分泌治療所處的線數將入組患者進行分組。因納入的一線內分泌治療的例數較少，因此，將患者分為一、二線組（n=11）和≥三線組（n=10）。

1.4 隨訪

所有患者的隨訪截止日期為2018年5月20日，隨訪時間為0.53～28.97個月，中位隨訪時間為5.03個月。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。建立COX比例風險回歸模型進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ESR1檢測結果與患者基線資料

53例患者中，ESR1突變患者為21例，ESR1非突變患者32例。21例ESR1突變患者中，6例患者D538G 突變，突變率為28.6%（6/21）；13例患者Y537S突變，突變率為 61.9%（13/21）；2例患者D538G和Y537S雙位點突變，突變率為9.5%（2/21）。根據ESR1的突變情況將患者分為ESR1突變組和ESR1非突變組。ESR1突變組最常見的轉移部位是骨和肝，且ESR1突變組的肝轉移率為66.7%（14/21），高于ESR1非突變組的34.4%（11/32），差異有統計學意義（χ2=5.306，P=0.021）。兩組患者的病理類型、Luminal分型、月經情況、腫瘤家族史等基線資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 ESR1突變和ESR1非突變患者的基線資料比較

在21例ESR1突變患者中，7例患者及時更改治療方案，且均將化療作為下一步的治療計劃；12例患者繼續采用原方案進行治療；1例患者因身體狀態極差無法繼續接受治療；1例患者死亡。

2.2 ESR1突變與內分泌治療的關系

ESR1非突變組的平均內分泌治療線數為（1.50±1.14）線，明顯少于ESR1突變組的（2.62±1.20）線，差異有統計學意義（t=-3.427，P＜0.01）。既往使用過AI患者的ESR1突變率為42.9%（18/42），既往未使用過AI的患者的ESR1突變率為27.3%（3/11），兩組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 ESR1突變與內分泌治療效果的關系

2.3.1 ctDNA檢測ESR1對療效評價的時效性本研究發現，相較于傳統的影像學或者腫瘤標志物評估方法，ctDNA可平均提前70.1天發現疾病進展。

2.3.2ESR1突變與PFS的關系 本研究的隨訪率為100%，49例患者到達研究終點。ESR1非突變組的中位 PFS 為5.8個月（95%CI：2.9～8.7），ESR1突變組患者的中位PFS為4.6個月（95%CI：3.7～5.5），兩組患者的中位PFS比較，差異無統計學意義（χ2=3.194，P＞0.05）。（圖1）

圖1 ESR1突變組（n=32）與ESR1非突變組（n=21）的無進展生存曲線

2.3.3 氟維司群治療對ESR1突變者PFS的影響在ESR1突變的患者中，氟維司群治療者13例，非氟維司群治療者8例（托瑞米芬4例，來曲唑1例，依西美坦3例）。氟維司群治療組患者的中位PFS為5.2個月（95%CI：3.9～6.4），HR=0.37（0.14～0.97），長于非氟維司群治療組患者的2.9個月（95%CI：0.6～5.3），HR=0.37（0.14～0.97），差異有統計學意義（χ2=4.556，P＜0.05）（圖2）。一、二線治療組中，氟維司群治療患者的中位PFS為5.0個月，雖長于非氟維司群治療的2.9個月，HR=0.40（0.10～1.62），但差異無統計學意義（χ2=1.857，P＞0.05）?！萑€治療組中，氟維司群治療患者的中位PFS為5.2個月，長于非氟維司群治療患者的2.1個月，差異有統計學意義（χ2=4.116，P＜0.05）。

3 討論

本研究是目前已知的中國人群中最大規模的檢測ctDNA中ESR1突變的臨床研究。本研究發現激素受體陽性晚期乳腺癌的ESR1突變率為39.6%，與FERGI和SoFEA研究結果的37.3%和39.1%基本一致[8,13]，但明顯高于Toy等[14]的結果，可能原因與本研究納入患者多為經治多次有關。此外，本研究發現ESR1突變中Y537S突變比例高達61.9%，遠超既往文獻報道[14-15]。主要原因考慮為本研究例數較少，但因為目前并無中國人群ESR1突變情況的統計，種群差異并不能完全除外。

圖2 氟維司群治療組（n=13）和非氟維司群治療組（n=8）的無進展生存曲線

與既往文獻報道相似，本研究發現ESR1突變多見于多線內分泌治療的患者中。機制可能是內分泌治療壓力下ESR1突變作為具有生存優勢的基因被選擇，逐漸成為腫瘤中占主導地位的細胞株[16]。除此以外，本研究發現ESR1突變人群的肝轉移率高于非ESR1突變人群，提示對明確已知ESR1突變的患者或多線內分泌治療之后的晚期患者及時、定期、規范地使用肝臟超聲、腹部增強CT或MR評估復查肝臟是十分必要的。

ESR1突變將產生AI類藥物的完全耐藥和他莫昔芬、氟維司群的部分耐藥[6]。SOFEA臨床試驗證明了ESR1突變患者中使用氟維司群比依西美坦有更長的PDF[8]。本研究也證實了ESR1突變者有較短的PFS，且氟維司群相較于AI類藥物可以帶來更多的治療獲益。在不同內分泌治療線數的亞組分析中，發現氟維司群在后線內分泌治療中優勢更加明顯。其可能原因是后線內分泌治療群體中內分泌治療的耐藥性升高，因而更能體現氟維司群克服ESR1突變耐藥的優勢。

ESR1突變在臨床中的應用仍然是疑惑重重。在本研究中，僅有1/3的ESR1突變患者根據基因檢測報告及時更換當前的治療方案。此外，雖然發現ctDNA可以比影像學或者腫瘤標志物平均提前70.1天發現腫瘤進展，但鑒于患者定期復查時間和腫瘤進展間固有的時間差，其真正領先時間及可靠性尚無法明確。因此，是否應該根據ESR1突變結果立即調整治療方案以及如何選擇最佳的后續治療方案都是亟需解決的問題。

即使氟維司群在內分泌治療中的地位逐步上升，但該研究發現其在ESR1突變群體的各線中位PFS時間僅3～5個月，耐藥后的進一步治療沒有統一的標準。隨著苯卓昔芬、RAD1901、GDC0810等新型雌激素受體拮抗劑在體內外實驗中表現出較好的療效[14,17]，今后將會有更多手段治療內分泌治療耐藥的患者。

ctDNA無創、方便等優勢為ESR1突變的動態監測提供了可靠的平臺。ESR1突變的監測應當從明確診斷乳腺癌開始，貫穿整個內分泌治療過程，從而進一步揭示ESR1突變產生的時機及與預后的關系，優化臨床決策。盡早發現ESR1突變以便及時采取更優的治療方案。其實除了ESR1外，涉及內分泌治療耐藥的基因還包括分子磷脂酰肌醇-3-激酶、TP53、人表皮生長因子受體2、表皮生長因子受體等多種基因[18]。因此 Sefrioui等[19]、Gu 和Fuqua[20]提出了一個較為合理的監測體系和方法：在乳腺癌患者接受治療前，使用NGS測序技術得出乳腺癌基線時的相關的突變，了解如ESR1，PI3K，TP53，HER-2，EGFR等基因突變的全貌以全面評估腫瘤的情況。針對性的治療后再定期用ddPCR去確認原先存在的突變，并比較治療前后的突變頻率是一種合理的方法。