牦牛和不育犏牛睪丸中LGR4和ZNF281基因mRNA水平的分析

于 淼，金素鈺，黃 林，雷杰雯，鄭玉才

(西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體4(LGR4)具有廣泛的生物學功能，包括成骨、能量代謝等[1-2]，近年來被認為參與Wnt通路的信號轉導[3-4].LGR4和促性腺激素受體同源，與動物生殖道發育和生殖機能相關[5-8].Qian等(2013)還報道，LGR4對精子發生是必需的[9].鑒于Wnt通路在動物發育中的重要性，LGR4在精子發生、睪丸發育中可能有重要功能.

鋅指蛋白281(ZNF281)是一種鋅指轉錄因子，也是胚胎干細胞的核心轉錄因子.它與Nanog等轉錄因子作用[10]，參與細胞的多功能性、干細胞和上皮間質轉化(EMT)等調控以及DNA損傷導致的細胞應激[11-12].

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及毗鄰高寒地區特有的牛種，它與普通牛的雜交后代(犏牛)生產性能顯著提高，并能較好地適應高原低氧環境，但表現為回交三代內雄性不育，無法產生正常精子[13].因此，精子發生障礙被公認為與犏牛的雄性不育有直接關系.有關犏牛雄性不育的分子機制已有很多研究，犏牛睪丸中很多基因表達下調，包括在減數分裂過程中起重要作用的SYCP3、Dmc1、Dmart7等基因mRNA水平均極顯著低于牦牛[13-15]，但導致精子發生障礙的因果關系至今尚不明確.我們前期研究發現，犏牛睪丸中miRNA-449水平顯著低于牦牛，而其預測靶基因中包括LGR4和ZNF281等基因(李彩霞等，待發表資料).因此，本研究采用定量PCR方法比較牦牛和犏牛睪丸LGR4和ZNF281的mRNA水平，以探索其在犏牛雄性不育中可能發揮的作用.

1 材料與方法

1.1 組織采集與處理

實驗成年牦牛(n=10)和犏牛(n=7)的睪丸均采自成都市青白江某屠宰場.于10月份在牦牛和犏牛屠宰后立即采集睪丸，迅速切割成小塊后置于含RNA保護液(Qiagen)的EP管中，冰上帶回實驗室，-80℃保存備用.

1.2 睪丸總RNA提取和反轉錄

稱取睪丸約100 mg于研缽中，用液氮充分研磨，用RNAiso Reagent試劑(TaKaRa公司)根據說明書提取總RNA.利用核酸蛋白檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性.取1 μg總RNA按照RNA Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa公司)說明書反轉錄成cDNA，保存于-20℃.

1.3 基因的定量PCR檢測

根據NCBI中普通牛18S rRNA、GAPDH、LGR4和ZNF281基因的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設計兩個目的基因和雙內參18S rRNA、GAPDH基因的定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.

表1 本研究PCR引物信息Table 1 Sequences of PCR primers in the present study

定量PCR在Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上完成，反應體系(25 μL)：SYBR?Green PCR Kit(QIAGEN 公司生產)12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，超純水9.5 μL.反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，退火(18S rRNA和GAPDH均為60℃，LGR4為64℃，ZNF281為65℃)20 s，72℃ 15 s，共40個循環.

以反轉錄獲得的牦牛睪丸cDNA為模板，用4對定量PCR引物分別進行常規PCR擴增，產物經10倍稀釋(10-4～10-8)的5個梯度作為模板，進行反應體系和條件優化，制作標準曲線，并獲得融解曲線、線性范圍等參數.進一步利用建立的定量PCR方法，對牦牛和犏牛睪丸樣品中目的基因和2個內參基因進行定量.樣品均做兩管平行，并設無模板對照.

1.4 數據統計分析

實驗數據用平均值 ±標準誤表示.采用 SPSS 18.0軟件，根據兩個內參基因18S rRNA和GAPDH表達水平的幾何平均數，對LGR4和ZNF281 mRNA表達水平分別進行矯正，并以2-ΔΔCt法對數據進行處理[16].

2 結果

2.1 總RNA提取和定量PCR方法建立

實驗提取的睪丸總 RNA的 A260/A280為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的條帶，且28S rRNA條帶亮度是18S rRNA的約2倍，質量符合定量PCR分析的要求.常規PCR擴增顯示，LGR4和ZNF281基因的PCR產物均為特異的單一條帶，與預期分子量大小一致.

建立的定量PCR方法中，4個基因在較寬范圍內均有很好的線性關系，其中LGR4和ZNF281基因的標準曲線的相關系數分別為0.998和0.994，擴增效率分別為96.1%和104%，融解曲線均只有1個峰(圖1)，表明擴增特異性強，符合定量PCR分析要求.

圖1 LGR4基因(A)和ZNF281基因(B)的融解曲線和標準曲線Fig.1 Melting curves and standard curves for LGR4 gene(A)and ZNF281 gene(B)

2.2 牦牛和犏牛睪丸LGR4和ZNF281 mRNA水平的比較

定量PCR分析表明：LGR4和ZNF281基因在牦牛和犏牛睪丸中均有較高表達.牦牛和犏牛睪丸中LGR4 mRNA水平差異不顯著，而牦牛睪丸中ZNF281 mRNA水平極顯著高于犏牛(P＜0.01)，相差約4.7倍(圖2).

圖2 牦牛和犏牛睪丸中LGR4基因和ZNF281基因的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of LGR4 gene and ZNF281 gene in the testes of yaks and cattle-yaks

3 討論

犏牛睪丸無法產生正常的精子.已有研究表明，雄性不育犏牛睪丸中很多與繁殖相關的基因表達下調[13-15，17].利用轉錄組和蛋白質組學技術，也檢測到牦牛和犏牛睪丸中眾多差異表達基因[18-19].有報道LGR4對精子發生是必需的[9].本研究中牦牛和犏牛睪丸LGR4 mRNA水平沒有統計學上的顯著差異(圖2A)，推測該基因可能不是導致犏牛雄性不育的主要原因.精子發生涉及復雜的基因調控網絡，我們曾發現犏牛睪丸中MAPK信號轉導通路中的信號分子表達顯著下調[20].由于LGR4與Wnt信號通路有關，推測犏牛睪丸中該通路與精子發生障礙的直接關系不大.

鋅指蛋白基因是哺乳動物基因組中最大的基因家族之一，其中一些在睪丸中表達水平高，并與精子發生相關，如 ZFP393、ZNF313、ZNF230 等[21-23].有關ZNF281的研究很少，它是重要的轉錄因子，在干細胞的分化中發揮重要作用[24].犏牛睪丸中ZNF281基因表達顯著降低，有可能通過影響睪丸中的細胞分化而影響精子的發生，導致雄性不育.上皮間質轉化是組織細胞發育中的重要機制，ZNF281可被該過程誘導，但被miR-34a抑制[11].犏牛睪丸細胞組成與牦牛不同[25]，可能是導致其ZNF281基因表達下調的主要原因.我們過去的研究也表明，另外一種鋅指蛋白Prdm9在犏牛睪丸中的表達也顯著下降[25]，提示雄性不育犏牛睪丸中的信號通路存在障礙.至于牦牛睪丸miRNA-449水平與ZNF281基因表達的關系需要證實.根據本研究結果，推測ZNF281基因在犏牛精子發生中可能有作用.