環境DNA宏條形碼監測水生態系統變化與健康狀態

李飛龍，楊江華，楊雅楠，張效偉

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，江蘇 南京 210023

人類活動產生的水體污染、棲息地破壞、資源過度開發、外來生物入侵等環境壓力，造成生物多樣性銳減，引發水生態功能嚴重退化并影響人類健康[1]。據2016年《地球生命力報告》統計，1970—2012年，淡水生物數量整體下降了81%。而且，在全球氣候變化的大背景下，人類活動對水生態系統的擾動越來越大，環境壓力愈加普遍和強烈[2]。面對日益惡化的水生態狀況，環境管理者、科學家及社會環保組織在進行水環境保護時面臨巨大挑戰。實際上，水生態環境保護措施的有效性在于對生態系統變化快速可靠的識別。然而，傳統形態學生物監測存在費時費力、物種分辨度低、成本高等諸多缺陷[3]，一直以來飽受詬病，無法在流域尺度開展大規模、高頻率的生態監測。因此，迫切需要更加便捷且準確的水生態監測技術，用于生物多樣性及水生態系統的保護。

從水、土壤、沉積物和冰芯等環境介質中提取DNA(以下簡稱環境DNA)進行高通量測序，可同時實現對自然生態系統中多生物群落的監測，被認為是一種快速且有效的監測技術，通常被稱為環境DNA技術[3]。在水生態系統中，環境DNA主要源于生物有機體釋放到水體的粘液、唾液、糞便、尿液、血液、內含物、孢子、花粉或脫落的器官等[3-5]。環境DNA普遍存在，加上該技術具有的監測所有生物的潛能，促使其形成了一個新興的研究領域[4]。在歐美等發達國家，基于環境DNA技術的底棲動物[6]、魚類[7]、兩棲動物[8]、外來入侵物種[9-11]和瀕危稀有物種[12]監測已有廣泛研究。此外，環境DNA技術與機器學習、遙感等技術結合來評價水生態系統健康也已成為生態學的研究熱點[13]。但相比于歐美等發達國家，中國開展的環境DNA研究相對較少，僅被用于魚類[14-15]和入侵小龍蝦[16]等的監測。盡管已有文獻對環境DNA的研究進行了總結，但其更偏重于討論該技術在特定物種的有無或豐富度監測和生物多樣性評估等方面的應用[17-18]。作為對已有文獻綜述的補充，筆者將從生態環境監測及跨學科聯用的角度思考環境DNA的應用前景，希望為中國開展相關研究提供一些啟示和思路。

研究重點分析以下幾個方面：①簡要總結環境DNA技術在生物監測方面多元化的應用；②著重討論環境DNA技術與機器學習、遙感等技術跨學科協調合作進行水生態監測的潛在機遇；③探討作為水生態環境保護的主體，社會公民(特別是“公民科學團體”)在未來環境監測中可發揮的作用及潛力，這將對中國開展基于環境DNA技術的流域生態監測提供一定的參考。

1 環境DNA技術的原理及應用

1.1 環境DNA技術的原理及發展

環境DNA技術是指通過從環境介質(水、土壤、沉積物等)中提取DNA，對基因組的特定DNA片段進行PCR擴增和高通量測序，從而實現對環境樣品中多生物群落監測的技術[3-5]。該技術基本操作流程主要包括環境樣品采集、DNA提取、PCR擴增、DNA文庫構建、DNA高通量測序、生物信息學分析和生物多樣性分析等環節(圖1)。

圖1 環境DNA技術基本操作流程圖Fig.1 The basic operational flowchart of environmental DNA approaches

早在20世紀80年代，環境DNA技術就已被提出用于微生物研究[19]，通過獲取DNA序列推斷微生物的分類及其賦有的生化意義[20]，從而實現對不可培養微生物的認識。自2003年DNA條形碼概念[21]提出以來，環境DNA技術在短短的10多年間發展迅速。生命條形碼聯盟(CBOL)將DNA條形碼定義為生物基因組中普遍存在的一段能夠高效鑒定物種的 DNA 標準區域。其建立在2個前提之上：①每個物種應有唯一的 DNA 條碼序列；②物種間的基因遺傳變異應大于物種內的基因遺傳變異。DNA條形碼最初目的是進行生物種分類鑒定及數據的儲存，以期快速準確地鑒定物種，并發掘新種及隱匿種，現已在動植物和微生物等各類生物中得到廣泛的應用[21-25]。受益于DNA條形碼的研究，2008年FICETOLA等[10]提出利用特異性的DNA片段檢測水域內美國牛蛙的入侵，自此開啟了環境DNA技術在水環境監測中研究與應用的先河。近年來，對環境DNA的研究在不斷發展和深化，已從單一化的靶向物種(外來物種入侵、珍稀及瀕危物種)監測到非靶向多元化生物群落調查，再到作為新型的高通量分子指紋用于環境污染物的診斷、水環境健康評價及污染物生態閾值推導等(表1)。

表1 環境DNA技術在生態監測領域主要研究Table 1 Main research of environmental DNA approaches in the field of ecological monitoring

此外，環境DNA技術較高的成本效益也是促進其發展與應用的重要因素之一。據研究發現[50]，相比于傳統生物監測技術，僅單個監測位點環境DNA技術就可以節省超過40%的成本投入。而且，隨著監測位點數量的增加，成本效益的優勢會更加凸顯。隨著大數據、云服務和人工智能領域的快速發展，環境DNA技術在多學科、跨領域間的交流與合作也值得期待。

1.2 物種豐富度和相對豐度評估

對物種豐富度和相對豐度評估是探索、認識物種和保護生物多樣性的基礎。傳統基于物理、聲學和視覺觀察的生物監測是當前評估物種多樣性的主要方式[51]，但它們存在很大的局限性。即使是高水平的物種鑒定專家，對某些生物類群的錯誤識別也很常見。而且，傳統監測方法對環境和生物群落會造成破壞性的影響[3]。對于許多兩棲動物和爬行動物，傳統方法可能需要專門的設備或特定的觀察時間，從而使物種多樣性評估難以進行[52]。由于環境DNA技術可同時監測多生物群落且具有較高的物種辨識度等，很好地彌補了傳統監測方法的不足。已有研究發現環境DNA對兩棲動物的監測要優于傳統方法[53]。此外，通過對食血水蛭體內宿主血液的收集，可實現對瀕危和隱匿的脊椎動物的有效監測[54]。對植物的研究也發現，相比于視覺方法，分離空氣中的DNA可以提高對花粉的分類辨識度[55]。

環境DNA技術還可以用于物種的相對豐度評估。大量的研究發現，通過使用特異性引物或定量PCR(qPCR)技術，可以實現單物種相對豐度的測量[7,43]。雖然這些研究都需要進行大量的控制實驗，以確定在qPCR中所觀察到的物種相對豐度與基因拷貝數之間的關系，但至少可以證明環境DNA包含了物種相對豐度的信息。目前，雖然利用環境DNA度量生物群落豐度仍缺乏結論性證據，但已有研究認為，DNA序列的相對豐度與傳統方法評估的物種豐度存在明顯正相關。如在中宇宙模擬實驗中發現，魚類和兩棲動物的個體數與相對豐度均與DNA序列數存在相關性[56]。類似結果也出現在自然湖泊中，傳統刺網的漁獲量與同時開展的環境DNA監測結果存在正相關[57]。對海洋的研究也指出，將DNA序列在科級水平進行統計時與傳統拖網捕獲的魚類相對豐度及生物量有相關性[58]。

1.3 靶向與非靶向的生物監測

環境DNA技術最初被用于法國池塘中北美牛蛙的監測[10]，隨即引起了研究人員和環境監管部門的極大興趣，目前已被成功用于亞洲鯉魚[37]、克氏原螯蝦[11]、娃娃魚[12]等入侵生物的監測。以上這些研究均以物種特異性引物為基礎，目的是為入侵生物監測提供新證據。這種靶向的方法在入侵生物學領域被稱為“主動”監視[59]。尤其在自然資源管理中，為避免未來引進及減少現有外來入侵生物的傳播時，這種“主動”監測至關重要。但是，環境DNA技術還存在一個重要挑戰，即入侵物種檢測的假陽性和假陰性，這2種情況都會引起生物監測結果的不確定性，為入侵生物的根除和控制帶來巨大負擔。因此，仍需要繼續開展研究，減少或了解產生假陽性和假陰性的原因，提高環境DNA對外來入侵生物監測的準確性。

與“主動”監視相對應的，環境DNA技術還能同時利用不同引物進行多生物群落的監測，從而快速了解環境中生物群落組成，這種被廣泛應用的非靶向方法被稱為“被動”監視[59]。在分析環境變化對水生態系統的影響時，除了進行靶向的生物監測，仍然需要在多生物群落和不同營養水平上進行生物多樣性的研究，分析并預測生物多樣性改變對生態功能的影響。環境DNA具有促進生物多樣性和生態系統功能研究的潛力[42]，提高研究人員對捕食者和被捕食者關系的認識(如植物與傳粉者的相互作用)[60]，以及在高度多樣化的系統中了解小型隱匿物種組成的食物網[61]。這些研究可以揭示物種共生作用和相互作用，將進一步促進研究人員對復合生態系統的理解，并提供用于指導大生態系統尺度的管理決策。環境DNA 技術還可以為評估人為污染的影響提供一個強有力的工具，如在“河北精神”號溢油事件發生后7年，環境DNA被用于表征表層沉積物微觀和宏觀生物群落結構的變化。該研究結果表明原油泄漏污染對微生物群落和后生動物群落產生了長期的影響，這些影響體現在生物多樣性、優勢物種的相對豐度和結構變化上[32]。

1.4 古生態學領域的應用

研究生態系統演替規律和污染物的生態群落效應時，傳統毒性實驗、微/中宇宙模擬和全流域的生態調查都存在監測周期短的缺陷[62]。雖然依據考古或古湖沼學知識可以克服上述問題[63]，但仍然存在效率低和缺乏歷史資料等因素限制。近年來，從湖泊沉積柱或冰芯中獲得的DNA(常被視為“古DNA”)可記錄幾十年至上萬年的生物信息[64]。對湖泊沉積柱中動植物研究發現，早在1.26萬年前的陸地生物和水生生物可以被監測[65]，而從冰芯中獲取的DNA已經成功用于對2000年前生物群落的重建[66]。此外，從冰川徑流中提取的環境DNA，也可用來監測生活在冰川和冰下棲息的動物和植物的多樣性[67]。由于氣候變暖，這些棲息地正經歷著巨大的變化。與之類似，垂直運輸到海洋中的沉積物也會保存大量的DNA，因為這些DNA被直接吸附到泥沙顆粒上，使其可以避免核苷酸被氧化和水解等過程降解，有助于在大時空尺度上保存遺傳信號。該研究還發現，海洋沉積物DNA的濃度是海水中DNA的3個數量級[68]，海洋沉積柱也積累著大量的近海和遠洋生物群落遺傳信息。因此，沉積柱中的DNA是研究長時期動植物群落演替的有力工具，同時也提供了重建過去營養級關系的機會。如在食草動物中發現的小顆粒的環境DNA已經被用于古動物和古植物的鑒定[69]，利用糞便化石中的微生物和植物DNA痕跡可重建稀有和已滅絕的古鳥類飲食關系[70]。

沉積柱或冰芯不僅可以反映長時期生物群落演替動向，還能通過追蹤污染物的沉積歷史[71]，提供長期暴露于污染物下的群落生態效應信息[62]。因此，將環境DNA和古生態學/湖沼學有機結合起來，對理解長期人類活動及其產生的生態系統影響具有重要價值。

1.5 存在問題及解決建議

雖然環境DNA技術在生物監測中應用越來越多，但該技術仍存在一些不足。如在分析河流生物群落的空間分布時，盡管環境DNA技術可以檢出更高的物種豐富度，但DNA會沿著水流向下游遷移，導致識別的物種并非全部來自本地[72]。還有研究指出，環境中物種基因拷貝數受DNA來源、狀態和傳輸速率等影響[73]，使環境DNA反映的物種豐度與真實的物種豐度存在差異。此外，引物偏好性已經被證明會錯誤評估樣品中DNA序列的相對豐度[74]，而且在樣品處理過程中，過多的子樣本數量可以導致稀有的DNA序列丟失[75]。這些因素的結合可能會進一步放大任何已知物種DNA序列的偏差，并將完全抑制稀有物種的監測。

實際上，當一個物種的監測結果被懷疑時，可以使用qPCR來驗證結果的真實性，因為單物種特異性的qPCR不會存在引物偏好性的問題。此外，增加重復樣品數量和去除低豐度數據可以在一定程度上克服假陽性問題[76]。為確保樣品的完整性，實驗室陰陽對照樣本的設置極為重要。使用陽性對照樣本可以幫助評估環境DNA的測序效率和錯誤率[77],而在實驗室操作過程每個階段(如樣品過濾、DNA提取、PCR和測序)設置的陰性對照可通過統計模型等方法檢測高通量多通道測序過程中產生的錯誤，以排除假陽性檢測。最后，由于數據處理過程也會影響研究的結果和結論，生物信息學工具的選擇和參數設置也必須要慎重。

2 環境DNA技術跨學科合作潛在機遇

2.1 機器學習——智能化的生態監測

大數據和云服務時代的到來對數據的探索、分析和預測提出了更高的要求。作為探索和分析數據的基礎理論和工具，機器學習及數據挖掘成為當前熱門的技術。機器學習的核心是通過數據統計和邏輯推理讓計算機將海量信息轉化為可行的情報并做出正確反應的科學。這種方法在社會科學和分子/遺傳學科已得到了廣泛的應用，但直到最近才被應用到生態學領域[34,78]。對于生態監測數據，研究人員通常使用統計模型(如回歸模型)來研究生物群落繁殖、遷移和捕食等作用關系。但是，機器學習可以根據數據運算和邏輯推理完成數據集中相互作用的生態網絡關系重建。只要方法合適，機器學習能快速地從生態監測數據中重建生態網絡，顯著提高建立生態作用網絡的效率。

當前，高通量測序一次可完成10～100 G的測序數據。這一優勢使得環境DNA生態監測成為名副其實的大數據監測，傳統的數據分析方法顯然無法適應高通量數據分析。如果將環境DNA技術與機器學習、云服務進行耦合，可以構建一個系統性、全球化、網絡化的快速生態監測體系。但是這種基于邏輯推理從高通量測序數據中重新構建生態網絡的研究仍需進一步完善。有研究指出，對高通量測序數據使用統計推理方法構建的微生物網絡在精確度和靈敏度上存在很大的差異[79]，而且這種生態網絡與現有的知識存在矛盾。但是在一項關于浮游生物的研究中發現，利用機器學習可以很好地從高通量測序數據中重構生物網絡關系[80]。因此，這些研究結果的差異也說明基于機器學習的高通量測序數據分析還存在很大的提升空間。

環境DNA生物監測也是一把“雙刃劍”，雖然可以獲得傳統形態學監測無法獲取的群落大數據信息，但同樣面臨如何理解這些數據的困境。由于全球范圍內DNA參考數據庫并不完善，測序產生的大量DNA操作分類單元(OTUs)無法完成序列注釋，特別是宏基因組的測序，有時85%以上的序列是未知的[26]。在進行數據分析時如果丟棄這些未知的OTUs，將會造成海量信息的遺失。機器學習正成為克服這一困難的有效工具。最近有研究提出，使用監督式機器學習可以完成非注釋性OTUs的生物指數計算，而且這些新型的分子生物指數具有很好的水生態健康評價潛力[34]。在細菌和硅藻研究中，這種方法也被用于污染水平的預測和生態風險評價[34-35]。

2.2 遙感——實現全球化的監測網絡

遙感技術是指從遠距離感知目標反射或自身輻射的電磁波、可見光、紅外線等，完成對目標探測和識別的技術。該技術具有獲取全球性數據的優勢，而且遙感數據具備在時空尺度上標準化和可重復性。盡管遙感最初的開發和部署成本很高，但穩定的衛星傳感器將持續提供最具成本效益的長期監測能力。最近，傳感器技術的發展為水生態系統監測開辟了新思路。通過地球觀測平臺可獲得越來越高的空間和光譜分辨率數據，這些數據可以用來度量生物指標的變化(如水生植被覆蓋面積和葉綠素a濃度)[51,81]。目前，衛星遙感技術已被應用于湖泊中生物多樣性的監測，如Diversity II(www.diversity2.info)和Globolakes(www.globolakes.ac.uk)等監測項目已經分別覆蓋了全球340、971個湖泊。此外，新型的高光譜技術，通過分析數百個狹窄的光譜帶可提供水體中藻青素、葉綠素a、懸浮物、浮游植物功能類型和底棲生物組成等更多的信息[82]。還有，在無人機等小型機載設備上搭載輕型高光譜相機，可彌補衛星無法監測的河流源頭信息[83]。利用歷史航空圖像和地圖的存儲庫，遙感也可用來評估過去的環境壓力(如歷史航拍照片被用來量化大壩建設和人類用水對河道的影響)。

遙感技術與環境DNA的結合將為未來環境監測提供更多可能性(如將歷史衛星圖像與古環境DNA結合，可以重建過去生物群落對環境壓力的響應，評估生物多樣性隨時間的變化趨勢[84])。此外，利用衛星光譜圖像解譯的水生植被覆蓋面積、葉綠素a濃度等信息，與環境DNA的高通量監測信息結合，可用于預測富營養型湖泊藻華的暴發,該領域的研究將會有很好的發展前景[81,85]。特別是在當前人類活動產生的多元化環境壓力下，監測數據的豐富性和連續性是分析生物多樣性和生態系統變化的一個關鍵因素，這主要是因為對生物多樣性造成威脅的環境壓力范圍廣泛，而且往往會跨越很長一段時間。

2.3 公民科學團體的參與

環境DNA技術的便捷和可操作性，使其為推廣全民參與的生態環境保護監測項目創造了新途徑。特別是環境DNA分析試劑盒商業化(如NatureMetrics，Spygen，QIAGEN等)更推動了公民科學項目的發展。公民科學團體是收集或處理數據的志愿者，通常是在科學項目的支持下進行的。涉及公民科學的研究項目正隨著公眾對生態環境的保護興趣日益增加而增長。因此，公民科學團體正越來越多地擴大對不同時空范圍的水環境監測。如基于公民科學的全球湖泊生態觀測網(GLEON，http://gleon.org/)已建立了一個全球范圍內的數據采集網絡，收集不同湖泊的數據以記錄對不同的環境壓力的響應，包括水溫、溶解氧和浮游植物葉綠素熒光等。與此類似的，國際河流組織(www.internationalrivers.org/worldsrivers)開展了全球范圍內50個主要河流的健康狀況評價。盡管大部分指標都與環境驅動因素有關(如水壩數量和入侵魚類的百分比)，但也存在一些生物指標(如關注哺乳動物和鳥類)。在英國，由公民科學家組成的Riverfly Partnership(http://www.riverflies.org/)，其成員都接受了簡單的無脊椎動物監測技術培訓，開展英國河流的健康評價。在南非，miniSASS(http://www.minisass.org/)采用了類似的方法進行水環境保護。重要的是，這些團體組織和他們的在線數據存儲庫都在不斷擴大。如果這樣的項目(計劃)擴展到其他國家，并將這些數據在全球數據庫中分享，將會使整個河流健康狀況得到改善。

在中國，人們對水環境質量的理解正在不斷深入。單純的水化學污染控制顯然不能滿足新時期水生態環境保護的需求。對應于中國尚不完善的生物監測體系，基于公民科學的全民水環境保護計劃也處于發展的新階段。為了吸引更多的公民參與其中，環境管理者和科研人員相繼做出了很多的努力。如由生態環境部與住房和城鄉建設部共同發起的城市黑臭水體整治環境保護專項行動(http://www.hcstzz.com/)，每周會定期發布《全國城市黑臭水體整治公眾監督及回復情況周報》，目的是加強社會公眾對水污染治理的監督和參與度。此外，以鼓勵公眾參與為目的的河流生態地圖項目(http://nju.erivermap.com/water/)日益得到社會群眾的關注，該項目旨在利用環境DNA技術對全國各地的水體進行生態監測，提供河流、水庫、湖泊等生態系統的生物多樣性分布地圖，建立水生態健康評估報告，完成全國水環境健康狀況的評價。這些項目的實施將會逐步增加公眾的水環境保護興趣和熱情，進而推進公民科學在中國的發展。

3 結論

水生態系統變化的早期識別和對人類活動壓力的診斷可有效保護水生態環境。同樣，對水生態環境治理與修復措施的評估也需要精確監測生態系統質量的變化。對生態系統中物種多樣性、結構及組成的觀測，可以用于研究這些物種如何塑造生態系統。迄今為止，大多數研究都集中在較小時空尺度上，而許多與大尺度和長時間跨度有關的問題都沒有得到解答，但是這種在時空尺度上的研究限制正在被改變?；诟咄繙y序的環境DNA技術與遙感、機器學習、云服務等技術耦合，產生的監測大數據將會為未來幾十年生態學研究帶來巨大的機遇。這些新技術除了提供新穎的數據獲取方法外，還可以提供從局部到全球范圍以及多層次(如單一群落到生態作用網絡等)的生態系統動態信息，進而改變人們對生態系統變化的理解，還可以更準確地預測環境變化造成的生態后果。此外，作為水生態環境保護的主體，社會公民應該被鼓勵加入進來。這一便捷和可標準化操作的環境DNA技術，將會為推廣全民參與水環境保護行動創造新途徑。