顯微鏡計數法測定浮游植物的研究進展及修訂建議

鐵 程，張榆霞，金 玉，趙琦琳，施 擇，李愛軍，李 穎

云南省環境監測中心站,云南 昆明 650034

浮游植物一般指浮游藻類，是懸浮于水中生活的微小藻類植物[1]。浮游植物的種類組成特點和數量的變化，能敏感地反映復雜的環境因子變動[2-3]。武漢東湖30年來浮游植物的演變規律以及國內許多同類調查研究都證明：湖泊(水庫)浮游植物數量的增加，特別是藍藻豐長和生長季節的延長是湖泊富營養化的一個重要標志[4]。因此，浮游植物群落結構特征和時空變化是水環境監測、水質評價、水環境污染研究、水體生態修復和治理的重要內容[4-8]。

顯微鏡計數法是淡水浮游植物測定最常用的經典方法，不僅可以測定浮游植物生物量，還可以進行浮游植物的種類及群落結構分析[9]。國內開展顯微鏡計數法測定浮游植物密度的主要依據有《內陸水域浮游植物監測技術規程》(SL 733—2016)、《水和廢水監測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養化調查規范(第二版)》[11]以及《湖泊生態調查觀測與分析》[1]等規范和文獻。美國、英國和歐盟等國家和地區也制定了相關標準和規范。如英國的WaterQuality-GuidanceStandardontheEnumerationofPhytoplanktonUsingInvertedMicroscopy(BS/EN 15204∶2006)[12]對浮游藻類樣品的保存、準備、計數、質量保證、不確定度的評估等方面進行了全面細致的規定。美國的StandardClassificationforSamplingPhytoplanktoninSurfaceWaters(D4149-1982)[13]規定了采集浮游藻類的常用技術和工具；StandardTestMethodforAnalysisofPhytoplanktoninSurfaceWaterbytheSedgwick-RafterMethod(D4148-1982)[14]對樣品的保存、前處理、藻細胞密度的測定過程、精密度和偏差的計算方法進行了規定。StandardPracticeforPreservingPhytoplanktonSamples(D4137-1982)[15]對浮游植物樣品保存試劑、條件和期限進行了規定。英國的WaterQuality-EnumerationofMicro-OrganismsinWaterSamples-GuidanceofVariationofResultwithParticularReferencetotheContributionofUncertaintyofMeasurement(BS 8496∶2007)[16]給出了在水生微生物定量分析中，測量不確定度對測定結果誤差貢獻的評估方法，并分析了實際案例。

國外相關標準中有一些方法和技術值得中國研究者學習借鑒，經驗證、轉化后能夠用于完善中國相關規范，更好地指導中國淡水浮游植物的測定。

1 國外相關分析標準

美國、英國和歐盟等國家和地區的標準在結構上有較大的區別。美國材料與試驗協會(ASTM)按采集、保存、分析將測定過程分為3個主要部分，用8個標準分別進行了規定。英國的BS/EN 15204∶2006標準[12]涵蓋了測定的全過程，并用BS 8496∶2007標準[16]規定了測量不確定度對測定結果誤差貢獻的評估方法。為便于介紹，按測定過程的主要環節(采樣工具、樣品保存、樣品前處理、樣品濃縮、計數對象、浮游植物在計數框中的分布、計數方式、適宜測定的密度、計數量與精密度、檢出限)對美國、英國和歐盟等國家和地區相關標準(表1)進行介紹。

表1 國外浮游植物測定標準Table 1 List of foreign methods about the enumeration of phytoplankton

1.1 采樣工具

美國的D4149-1982標準[13]規定了采集浮游藻類的常用技術。定性樣品的采集常用浮游生物網和泵。定量樣品的采集常用Clarke-Bumpus浮游植物采樣器、Juday浮游植物阱和采水瓶。使用者結合研究需要、采樣區情況和浮游藻類的天然特性選擇適合的工具和技術。針對每種采樣工具，分別制定了5個規程[17-21]。

泵、Clarke-Bumpus浮游植物采樣器和Juday浮游植物阱在國內較不常用，是一種用泵吸取所需深度的水樣，用網來富集浮游藻類的半定量采樣裝置，通過流量計測定進入采樣器水樣的體積實現半定量。采水瓶與國內常用的有機玻璃采水器類似。

1.2 樣品的保存

英國的BS/EN 15204∶2006標準[12]規定定性樣品不加保護劑，4～10 ℃暗處保存，36 h內完成分析；定量樣本加入魯哥氏液，使其在樣品中的濃度達到5%，常溫暗處保存3個星期，1～5 ℃保存1年。若保存時間要超過1年，則需要加入37%的福爾馬林溶液，使其在樣品中的濃度達到4%。美國的D4137-1982標準[15]規定了相同的保護劑，但對定性樣品的保存環境和保存時間要求更嚴格。

1.3 樣品的前處理

BS/EN 15204∶2006[12]非常重視樣品的混勻，將混勻視為對檢測結果有重大影響的步驟。該標準指出：為了統一不同測定人員的混勻操作，應該對混勻的方式、時間和力度等進行詳細描述和規定。多次水平搖動并結合上下顛倒樣品瓶的方式對樣品的混勻效果好于單一方向的搖動。搖動的力量不易過大，否則可能導致氣泡產生和群體的解離。該標準還提及：為了便于細胞計數，可以用超聲波震蕩儀對群體形式的浮游植物進行處理，以促進群體細胞的解離，但同時要注意避免過度處理造成浮游植物細胞破損。

1.4 樣品的濃縮

D4148-1982標準[14]指出：依據鏡檢結果和分析人員的經驗決定是否需要對樣品進行濃縮或稀釋處理。濃縮方式為量筒沉淀法。根據量筒中水樣的高度，按照4 h/cm計算沉淀時間。該標準還提及了一種稱重方法：稱取1 g左右的水樣于容器中，并記錄準確的稱重結果，待水樣中的浮游藻類充分沉淀后，移去大部分上層水樣，再進行稱重。用2次稱重結果計算濃縮倍數。

BS/EN 15204∶2006標準[12]指出：濃縮水樣中的浮游藻類比較耗時，且會引入誤差，因此，應當盡量避免濃縮處理?？梢圆捎贸恋?、離心或過濾的方式進行濃縮。沉淀是最常用的濃縮方式。加入到沉淀器中水樣的高度不能超過沉淀器直徑的5倍。

1.5 計數對象

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]未明確規定計數對象為細胞還是群體，而是指出以細胞為對象，計數結果較為準確，但比較費時；以群體為計數對象則較為方便，但計數結果較不準確。使用者可根據自己的需求和實際情況進行選擇，并在結果報告中說明。

BS/EN 15204∶2006標準[12]將情況分為3種：①當群體中的浮游植物細胞個體較易被辨識時，可將細胞作為計數對象；②當同種浮游植物群體中所含細胞數量穩定時，可將群體作為計數對象，用群體數乘以群體中平均細胞數；③當不具備上述2個條件時，采用超聲波震蕩或水解方式離散群體中的細胞，然后以細胞為對象計數。

1.6 浮游植物在計數框中的分布

BS/EN 15204∶2006標準[12]認為浮游植物隨機分布于計數框中是按標準開展測定、估計測定誤差的前提，并提出了一些保障措施：在計數之前，應在低倍數下，對整個計數框進行觀察，以確認浮游藻類是否為隨機分布；低溫保存過的樣品，需要將其放置至室溫后，再加入計數框中；如果樣品的溫度低于計數框，通常較大、較重的浮游植物會傾向分布于計數框的周邊，較小的浮游植物傾向分布于計數框的中央。

1.7 計數方式

BS/EN 15204∶2006標準[12]中提出了3種計數方式：隨機視野法、行條法和全片法，并指出隨機視野法能夠在工作量相對不大的情況下，給出相對最準確的結果。因為行條法只觀察了計數框的中間部分，如果浮游植物在計數框中的分布不均勻會影響結果的準確性，而隨機視野法能夠克服這個問題。

D4148-1982標準[14]中提出了2種計數方式和適用范圍：行條法適用于藻細胞密度較低的水樣、視野法適用于藻細胞密度較高的水樣。

1.8 最佳檢測范圍

BS/EN 15204∶2006標準[12]對適宜測定的浮游植物密度提出了定性要求：測試的水樣應滿足藻細胞之間、藻細胞與顆粒雜質之間不相互粘合或堆疊；過低的藻密度將導致大的隨機誤差；過高的藻密度將會導致觀察困難、耗時和測定人員的疲勞。

1.9 計數量與精密度

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出：浮游藻類的計數量由測定所需的精度決定。在日常分析工作中，應事先設定精度，精度可以由標準偏差、相對標準偏差、95%相對置信區間等表示，并且給出了相對標準偏差與計數量的關系式：

(1)

如將精密度(以相對標準偏差表示)設定為5%，則應該至少計數400個浮游藻類。

如果精密度由置信區間表示，則用公式(2)計算：

(2)

如當浮游藻類計數量為400個時，95%置信區間為測定結果±10%。

StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]中給出了與公式(2)類似的計算方法。2個國外標準均指出：浮游植物隨機分布于計數框中，是準確估計最少計數量或精密度的前提和保障。

1.10檢出限

BS/EN 15204∶2006標準[12]認為檢出限是浮游植物測定方法的重要性能指標。對于隨機分布于計數框中的單種藻類，檢出限可由泊松統計模型得到。

(3)

式中:α為顯著水平；ndet為檢出限；ftotal為計數框的總視野數；fcounted為被計數的視野數。

2 國內相關規范

《內陸水域浮游植物監測技術規程》(SL 733—2016)、《水和廢水監測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養化調查規范(第二版)》[11]、《湖泊生態調查觀測與分析》[1]等是國內顯微鏡計數法測定浮游植物密度的重要標準和規范性文獻。在樣品的采集、保存和濃縮方面，它們均采用了25號浮游生物網采集定性樣品；用有機玻璃采水器采集定量樣品；用魯哥試劑或福爾馬林試劑保存定量樣品；用沉淀法和虹吸法濃縮水樣中的浮游植物。樣品的測定方面，它們均采用了中國通用的面積為20 mm×20 mm、容量為0.1 mL的浮游植物計數框，框內劃分橫豎各10行、10列，共100個小方格。計數方式主要有全片法、行格法、視野法和對角線法。觀察和計數全部100個小格的全片法較耗時耗力，一般較多采用觀察計數框中的一部分區域的方法(如觀察藻類計數框中第2、5、8行，共30個小方格的行格法，觀察一定數量的顯微鏡可見區域的視野法，只觀察位于計數框對角線位置上的10個小方格的對角線法等)。質量控制方面，它們均規定“不大于±15%”，但對誤差的描述有所不同，分別為“兩片計數結果個數相差”“每次計數的結果與其平均值之差”和“相對偏差”。

3 國內規范中的不足

3.1 國內規范未對浮游植物在計數框中的分布提出要求

BS/EN 15204∶2006標準[12]很重視浮游植物在計數框中的分布，認為浮游植物隨機分布是準確測定和估計測量不確定度的前提。

對于僅觀察計數框中部分區域的計數方式，浮游植物在計數框中的分布對測定的精密度有較大影響。筆者分析了3家實驗室用對角線法重復測定洱海、撫仙湖和滇池水樣的結果(表2)。經統計分析發現，浮游植物在計數框中越符合泊松分布，重復測定結果的一致性越好。

《內陸水域浮游植物監測技術規程》(SL 733—2016)、《水和廢水監測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養化調查規范(第二版)》[11]和《湖泊生態調查觀測與分析》[1]等標準和規范性文獻沒有對浮游植物在計數框中的分布提出要求，也沒有給出促使浮游植物隨機分布于計數框中的有關措施。

3.2 國內規范未對設定最少計數量進行說明

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出由測定所需的精密度決定浮游植物的計數量，并給出了兩者的定量關系式。在開始測定前應先設定測定需達到的精度要求，然后根據定量關系式算出測定中所需的最少計數量。StandardMethodsfortheExaminationofWaterandWastewater標準[22]中提出可根據浮游植物的計數量估計測定結果的置信區間，相反也能夠根據測定誤差的要求，計算所需的最少計數量。

筆者分別應用對角線法、行格法和全片法對稀釋10倍、原水和濃縮10倍的洱海水樣進行了重復(7次)測定。通過統計平均計數量、平均觀察到的浮游植物種類數和重復測定結果的相對標準偏差(表3)發現：①隨計數量的增加，觀察到的浮游植物種類越多(圖1);②隨計數量的增加，重復測定結果越一致(圖2);③根據擬合方程的測算，當浮游植物最少計數量不少于1 200個時，相對標準偏差能達到小于15%的要求。牛海玉等采集了3座不同營養水平的水庫及3組不同處理的實驗圍隔樣品，對每個樣品進行了重復測定，同樣發現隨計數量的增加，浮游植物豐度偏差減小，并且隨計數量增加鏡檢到的浮游植物種類數增加[23]。

表2 3家實驗室重復測定結果及統計分析結果Table 2 Repeated measurement results and statistical analysis results in three laboratories

表3 重復測定結果統計Table 3 Statistical results of repeated determination

圖1 浮游植物細胞計數量與觀察到的浮游植物種類的關系Fig.1 Relationship between phytoplankton counts and observed phytoplankton species

圖2 浮游植物細胞計數量與重復測定結果一致性的關系Fig.2 Relationship between phytoplankton counts and the consistency of repeated measurements

《水和廢水監測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養化調查規范(第二版)》[11]和《湖泊生態調查觀測與分析》[1]中未明確最少計數量的要求?！秲汝懰蚋∮沃参锉O測技術規程》(SL 733—2016)規定了計數量宜為500～1 500個，但表述過于簡單，未明確將計數量與精密度聯系起來，不便于測定人員根據測定要求設定合理的計數量。

3.3 國內規范未給出檢出限的確定方法

《內陸水域浮游植物監測技術規程》(SL 733—2016)、《水和廢水監測分析方法(第四版)》[10]、《湖泊富營養化調查規范(第二版)》[11]和《湖泊生態調查觀測與分析》[1]中沒有給出顯微鏡計數法的檢出限，也沒有給出確定檢出限的方法。雖然《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168—2010)中給出了確定檢出限的方法，但顯微鏡計數法與化學分析方法有較大區別，難以直接應用該導則中的方法確定其檢出限。

BS/EN 15204∶2006標準[12]提出了關于浮游植物的測定——顯微鏡計數法的檢出限定義:對于單種藻類，在單次計數過程中，發現它的概率不低于某個規定要求時，該藻類在水樣中的密度即為檢出限，并應用泊松分布模型計算滿足檢出限定義的藻密度。

借鑒BS/EN 15204∶2006標準[12]的定義和計算方法，將顯微鏡計數法的檢出限定義為對于單種藻類，在單次計數過程中，發現它的概率不低于99%時，最低的藻密度即為檢出限。以泊松分布模型為基礎，對國內規范中的對角線計數、行格計數、全片計數和隨機視野計數的檢出限進行計算。泊松分布模型計算公式為

(4)

式中：P(x)為連續觀察n個計數格，每個計數格出現x個藻細胞的概率；λ為單個計數格中浮游植物細胞平均數量，個；x為預計單個計數格中浮游植物細胞的數量，個；n為觀察的計數格數，個。

為結合實際測定過程，將上述檢出限的定義適當轉化為對于單種浮游植物，連續觀察計數框中的n個計數格后，未發現它的概率為1%時，所對應的水樣中該種類浮游植物的細胞密度。根據定義可知：P(x)=1%、x=0，求λ。帶入式(4)得到式(5)：

(5)

式中：λ為單個計數格中浮游植物細胞平均數量，個；n為觀察的計數格數，個。

再將λ的計算結果帶入式(6)，即可得出檢出限。

DL=Nλ/v

(6)

式中：DL為檢出限，個/L；N為計數框中計數格的總數，個；v為加入計數框中的水樣的體積，L。

對角線計數、行格計數檢出限的計算：已知N=100個，v=0.000 1 L，對角線計數、行格計數觀察的計數格分別為n=10、n=30個，將已知參數代入式(4)、式(5)可算得對角線計數、行格計數的檢出限分別為DL=4.6×105個/L，DL=1.5×105個/L。

全片計數檢出限的計算：當對整個計數框中全部100個計數格逐一觀察計數時，如果觀察過程十分細致，計數框中僅有1個浮游植物細胞也能夠被檢出。因此，全片計數法決定檢出限的環節是從樣品中吸取0.1 mL水樣裝入計數框時，吸取到0個藻細胞的概率為1%時，樣品中藻細胞的密度。因此需將式(4)、式(5)中各參數的意義調整為P(x)為0.1 mL水樣中含有x個藻細胞時的概率；λ為0.1 mL中含有藻細胞的平均數量，個；x為預計0.1 mL水樣中含有藻細胞的數量，個；n為從水樣中取樣的次數。

將式(6)改為式(7)：

DL=λ/v

(7)

式中：DL為檢出限，個/L；v為吸取水樣的體積，L。

已知：P(x)=1%，x=0個，n=1次，v=0.000 1 L，代入式(5)、式(6)后求得λ=4.6個、全片計數法的DL=4.6×104個/L。

隨機視野檢出限的計算：由于檢出限與觀察的視野數、視野面積和計數框面積有關，根據式(8)、式(9)計算：

(8)

(9)

式中：λ為單個視野中浮游植物細胞平均數量，個;n為隨機視野數，個；DL為檢出限，個/L；S為計數框的面積，cm2；s為一個視野的面積，μm2；v表示加入計數框中的水樣的體積，L。

如已知計數框的面積為S=4 cm2。顯微鏡放大倍數為400倍時，經校準得知1個視野的面積為s=90 716.8 μm2。在觀察了n=300個視野的條件下，經計算隨機視野的DL=6.8×105個/L。

表4 4種計數方式的檢出限Table 4 Detection limits of 4 kinds of counting pattern

注：隨機視野方式的檢出限與觀察的視野數、視野面積和計數框面積有關，應根據具體測定條件進行計算。

4 完善國內規范的建議

4.1 對浮游植物在計數框中的分布提出要求

浮游植物隨機分布于計數框中是提高測定精密度，準確估計測定誤差和確定檢出限的保障。因此，在相關規范中應提出“在開始顯微鏡計數前，應先確認浮游植物隨機分布于計數框中”的要求，并提出一些保障措施(如應在開始計數前在顯微鏡的低放大倍數下，對浮游植物在計數框中的分布進行確認，當滿足隨機分布時才開始計數；經低溫保存的樣品，在向計數框中加注水樣前，應將樣品在室溫下放置足夠長的時間，使水樣與計數框的溫度相同)。

4.2 對浮游植物的最少計數量提出要求

一般來說，測定中對浮游植物的計數量越多，重復測定結果間的一致性越好，同時觀察到的浮游植物種類數也越多。但一味增加計數量會造成測定時間的延長，會導致計數框中樣品的過量蒸發和空氣的進入，反而嚴重影響測定的準確性。因此在相關規范中應結合測定精度的要求，提出恰當的計數量，使測定方案一方面滿足精度要求，盡量減少遺漏的浮游植物種類，另一方面使工作量在可接受范圍內。

BS/EN 15204∶2006標準[12]中提出的：由測定所需的精度決定浮游植物的計數量(并給出了兩者的定量關系式)，為如何確定最少計數量提供了參考依據，值得國內相關研究人員參考和借鑒。

4.3 給出檢出限的確定方法

檢出限是分析方法重要的性能指標之一，在《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(HJ 168—2010)中規定，檢出限是環境監測分析方法的必備要素，在相關規范中應給出顯微鏡計數法的檢出限或檢出限的確定方法，但該導則中給出的確定檢出限的方法不適用于顯微鏡計數法。

BS/EN 15204∶2006標準[12]將顯微鏡計數法的檢出限定義為在測定過程中發現某種浮游植物的概率不低于某個要求時，該種浮游植物在水樣中的密度，并應用統計學方法計算出符合定義要求的浮游植物的密度。這種確定顯微鏡計數法檢出限的方法值得國內相關研究人員參考和借鑒。