秈粳稻兩個品種大米儲藏過程中蛋白質氧化對其蒸煮食用品質的影響

吳曉娟，吳 偉*

（中南林業科技大學食品科學與工程學院，稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004）

中國是世界上最大的水稻生產國和消費國，全國65%以上的人口以大米為主食[1]。隨著生活水平的提高，人們對大米的品質尤其是食味品質提出了更高的要求[2]。但大米在儲藏過程中會發生細胞結構損傷、化學成分改變、營養組分流失等一系列變化，導致加工特性和食味品質的下降。長期以來，淀粉的組成和結構變化被認為是影響大米及其制品糊化特性和食味品質的主要因素[3-4]。但越來越多研究發現，大米中蛋白質的組成和結構在儲藏過程中也會發生顯著變化，如清蛋白和球蛋白含量顯著下降，米谷蛋白結構發生顯著變化，蛋白質平均分子質量顯著增加等[5-8]。這可能是由于大米中脂肪氧合酶產生的脂質自由基和部分揮發性羰基化合物具有高度的氧化活性，使蛋白質發生氧化聚集和結構變化[9]。大米胚乳中淀粉顆粒由支鏈淀粉分子以疏密相間結晶區和無定形非結晶區組成，中間摻雜螺旋結構直鏈淀粉分子，蛋白質則分布在淀粉顆粒的外周，蛋白質氧化產生的共價交聯必定會影響大米淀粉糊化特性和米飯的食味品質[10]?！饍?07’是中國長江中下游稻區的主栽優質晚秈稻品種[11]，‘吉粳88’是中國東北稻區的主栽優質粳稻品種[12]，都具有較好的食味品質。本研究以新收獲大米‘金優207’和‘吉粳88’為原料，采用溫度37 ℃、相對濕度85%的條件進行加速陳化儲藏，測定儲藏過程中大米蛋白羰基、巰基和二硫鍵含量等氧化特征指標的變化，并將這些氧化特征指標與米粉糊化特性、米飯質構特性和感官品質進行相關性分析，研究蛋白質氧化對大米蒸煮食用品質的影響，以期為大米及其制品的保鮮儲藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新收獲大米（‘金優207’、‘吉粳88’） 湖南糧食集團有限責任公司；牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司；5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（5,5’-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB） 美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RXZ-128A型人工氣候箱 寧波市科技園區新江南儀器有限公司；FA25型高速分散均質機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；Sorvall LYNX6000型高速落地冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；LGJ-18型冷凍干燥機 北京四環科學有限公司；722s型可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；RVA-Super4型快速粘度分析儀 瑞典波通儀器公司；TA.XT Express質構儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 大米加速陳化儲藏

參考張珅鋮等[13]的方法，取適量‘金優207’和‘吉粳88’大米分別置于直徑200 mm的無蓋玻璃培養皿中，米粒厚度為10 mm，放入人工氣候箱中加速陳化儲藏，儲藏條件為溫度37 ℃、相對濕度85%，每周取樣。

1.3.2 大米蛋白制備

將儲藏不同時間的大米磨粉過80 目篩，按料液比1∶7（m/V）加入去離子水中，再用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下攪拌反應4 h，然后將懸浮液4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L鹽酸溶液調節pH值至4.0，靜置20 min，在4 ℃、8 000 r/min下離心15 min得到蛋白沉淀，用去離子水洗滌3 次后，再將蛋白沉淀分散于4 倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0，然后冷凍干燥得到大米蛋白。

1.3.3 大米蛋白羰基含量的測定

參考Huang Youru等[14]的方法，采用2,4-二硝基苯肼比色法在367 nm波長處測定吸光度，以22 000 L/（mol·cm）摩爾消光系數計算每毫克大米蛋白中羰基物質的量。

1.3.4 大米蛋白總巰基、游離巰基及二硫鍵含量測定

參考Beveridge等[15]的方法，采用Ellman’s試劑比色法在412 nm波長處測定吸光度，以13 600 L/（mol·cm）摩爾消光系數計算每毫克大米蛋白中總巰基和游離巰基物質的量，總巰基與游離巰基含量差值的1/2即為二硫鍵含量。

1.3.5 米粉糊化特性的測定

將儲藏不同時間的大米磨粉過80 目篩，再依據GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性測定 快速粘度儀法》[16]測定米粉糊化特性。

1.3.6 米飯質構特性測定

準確稱取20 g大米，洗凈后置于直徑70 mm、高38 mm的加蓋鋁盒中，加入相當于米粒質量2倍的蒸餾水，浸泡20 min后瀝干，然后加入相當于米粒質量1.4 倍的蒸餾水，蓋上鋁盒蓋后蒸汽蒸煮20 min，再靜置保溫10 min，得到米飯。采用質構儀在TPA模式下測定米飯的硬度、黏著性、彈性、咀嚼性、黏聚性和回復性。測定模式：選用P/0.5圓柱塑料探頭，測前速率1 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率10 mm/s；壓縮程度10 mm；保持時間5 s；觸發力5 g。

1.3.7 大米蒸煮食用品質感官評價

依據GB/T 15682—2008《糧油檢驗 稻谷、大米蒸煮食用品質感官評價方法》[17]進行大米蒸煮食用感官評價。首先參照附錄A的“評價員挑選辦法”，通過培訓和鑒別實驗挑選了10 名感官靈敏度高的人員作為評價員；然后，10 名評價員參照附錄B的“米飯感官評價規則和記錄表（評分方法一）”分別對不同儲藏時間的2 個品種米飯的氣味、外觀結構、適口性、滋味和冷飯質地5 個指標進行感官評價，再根據每個評價員的綜合評分結果計算平均值，計算結果取整數。每次品評，都會由10 名評價員共同選取1 份標準三等精度，綜合評分75 分左右的新鮮大米作為參照樣品。米飯感官評價標準見表1。

表1 米飯感官評價標準Table1 Criteria for sensory evaluation of cooked rice

1.4 數據處理

采用Excel 2003、SPSS 18.0軟件對數據進行分析，除感官評分，其余結果均用平均值±標準差表示；采用Origin 7.5軟件作圖，采用Pearson雙變量進行數據間的相關性分析，采用方差分析法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 大米在儲藏過程中蛋白氧化程度的變化

大米蛋白氨基酸分子中自由氨基和亞氨基極易受到活性氧攻擊，經反應最終生成氨氣和相應的羰基衍生物[18]。同時，L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys）巰基是最容易被自由基攻擊的氨基酸殘基，巰基轉變成二硫鍵或者其他物質是自由基引發的蛋白氧化過程中最早發現的變化之一[19-20]。因此羰基、總巰基、游離巰基和二硫鍵含量是目前最常用的衡量蛋白質氧化程度的指標。如表2所示，加速陳化過程中，‘金優207’和‘吉粳88’大米蛋白的羰基含量在1～4 周增加比較緩慢，4～12 周則顯著增加，12 周以后增加幅度又趨于平緩。隨著儲藏時間延長，‘吉粳88’大米產生的羰基含量逐漸高于‘金優207’，表明這兩種大米的蛋白氧化程度不斷增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金優207’更容易被氧化。兩種大米蛋白的總巰基和游離巰基含量均呈下降趨勢，且‘吉粳88’的下降趨勢更為明顯，也表明‘吉粳88’大米蛋白比‘金優207’更容易被氧化?！饍?07’大米蛋白二硫鍵含量無顯著變化（P＞0.05），‘吉粳88’二硫鍵含量增加較明顯，依據氧化環境和氧化強度的改變，蛋白質巰基的氧化可分為可逆氧化和不可逆氧化，可逆氧化主要是形成二硫鍵和次磺酸，不可逆氧化主要是形成亞磺酸和磺酸[21-22]；表明‘金優207’大米蛋白的游離巰基主要發生的是不可逆氧化反應，而‘吉粳88’既發生了可逆氧化也發生了不可逆氧化反應。

表2 儲藏過程中大米蛋白羰基、總巰基、游離巰基和二硫鍵含量Table2 Protein carbonyl, total sulphydryl, free sulphydryl and disulf i de contents of rice protein during storage nmol/mg

2.2 蛋白質氧化程度對米粉糊化特性的影響

大米及其制品的糊化特性一直是反映其食用品質的重要指標之一。兩種米粉的糊化特性參數如表3所示，儲藏過程中兩種米粉的峰值黏度均呈現先增后減的趨勢，‘金優207’的峰值黏度在第5周時達到最大值（3 610 cP），‘吉粳88’的峰值黏度在第10周時達到最大值（4 210 cP）。Indudhara Swamy等[23]在研究糙米和精米儲藏時也發現淀粉峰值黏度呈現先上升后下降的趨勢。這兩種米粉的最低黏度和衰減值隨著儲藏時間的延長沒有統一的變化趨勢，但最終黏度、回生值和糊化溫度隨儲藏時間的延長均呈逐漸上升趨勢。雷玲等[24]研究儲藏過程中不同品種稻谷的品質變化時也發現最終黏度和回生值都增大?；厣凳亲罱K黏度與最低黏度的差值，可以反映米糊在冷卻過程中的老化程度，回生值越大，表示米粉老化程度越大[25]。隨著儲藏時間的延長，‘吉粳88’的回生值增加程度要高于‘金優207’，這表明‘吉粳88’容易老化，不適于長期儲藏。

表3 儲藏過程中米粉的糊化特性Table3 Pasting properties of rice fl our during storage

Shibuya等[26]研究發現新鮮米粉和陳米粉的糊化特性有差別，但去除蛋白后的新鮮米淀粉和陳米淀粉卻沒有差異。Tan Yifang[27]、Zhu Lijia[28]等的研究也發現大米蛋白質含量不同是導致米粉與其對應的淀粉糊化特性差異的主要原因之一。Zhou Zhongkai等[29]研究發現高溫（37 ℃）儲藏的米粉經蛋白酶處理后，其峰值黏度和最終黏度發生了顯著變化。這些研究從側面反映了米粉糊化特性的變化主要是由大米的第二大組分蛋白質的組成和結構變化引起的。米粉糊化特征值與反映大米蛋白氧化程度指標的相關系數如表4所示，峰值黏度、最終黏度和回生值與大米蛋白羰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與總巰基和游離巰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01）。最低黏度與羰基、二硫鍵含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與總巰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與游離巰基含量呈顯著負相關（P＜0.05）；這表明，米粉糊化特性與大米蛋白氧化程度密切相關，且隨著蛋白質氧化程度的增加，米粉老化回生程度增加。

表1 米粉糊化特性與蛋白質氧化程度的相關系數Table1 Correlation coeff i cients between pasting properties and protein oxidation degree of rice fl our

2.3 蛋白質氧化程度對米飯質構特性的影響

如表5所示，隨著儲藏時間的延長，兩種米飯的硬度均呈逐漸上升趨勢，而咀嚼性、黏聚性、回復性、黏著性和彈性均呈下降趨勢?！饍?07’的硬度、黏聚性和回復性大于‘吉粳88’，而黏著性小于‘吉粳88’，兩者在咀嚼性和彈性方面差異不大。戰旭梅[30]對‘汕優63’、‘武粳14’、‘揚8’等的加速陳化儲藏研究中也發現質構特性發生了類似的變化趨勢。

米飯質構特征值與大米蛋白氧化程度的相關系數如表6所示。米飯硬度與大米蛋白羰基含量和二硫鍵含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與總巰基、游離巰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01）。咀嚼性和彈性與大米蛋白羰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；黏聚性、回復性與大米蛋白羰基含量和二硫鍵含量呈極顯著負相關（P＜0.0 1），與總巰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；黏著性與大米蛋白羰基、二硫鍵含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與游離巰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。這表明大米蛋白中氨基和亞氨基的氧化，即羰基含量的增加，對米飯的硬度、咀嚼性、黏聚性、回復性、黏著性和彈性等質構特性均有負面影響，使米飯食味品質逐漸下降；Cys巰基的氧化，即游離巰基含量的下降，主要對硬度、咀嚼性、黏著性和彈性有極顯著的影響；二硫鍵的形成主要對米飯的硬度、黏聚性、回復性和黏著性有影響。儲藏過程中米飯質構特性變差的原因可能是，蛋白質氧化導致位于淀粉顆粒外周的大米蛋白交聯度增加，抑制淀粉顆粒吸水膨潤，致使淀粉不能充分糊化，此外加熱時二硫鍵增多，蛋白質分子聚合為大分子，導致熟化食品質地變硬，咀嚼性、回復性、彈性等下降[31]。

表5 儲藏過程中米飯的質構特性Table5 Texture properties of cooked rice during storage

表6 米飯質構特征值與蛋白質氧化程度的相關系數Table6 Correlation coeff i cients between texture properties and protein oxidation degree of cooked rice

2.4 蛋白質氧化程度對大米蒸煮食用品質感官評價的影響

表7 儲藏過程中大米蒸煮食用品質感官評價得分Table7 Sensory evaluation of rice cooking and eating quality during storage

感官評價最能夠直接反映人們對米飯蒸煮品質的優劣判斷，兩種米飯的感官評價結果如表7所示，隨著儲藏時間的延長，兩種米飯的外觀、氣味、適口性、滋味和冷飯質地和綜合評分均降低。儲藏1～12周，‘吉粳88’的外觀、適口性、滋味以及綜合評分整體上高于‘金優207’，但儲藏后期‘金優207’的各項指標則逐漸優于‘吉粳88’；這表明相比于‘金優207’，‘吉粳88’在儲藏過程中感官品質劣變程度更大。

表8 大米蒸煮食用品質感官評價與蛋白質氧化程度的相關系數Table8 Correlation coeff i cients between sensory evaluation of cooking and eating quality and protein oxidation degree of rice

米飯感官評分與大米蛋白氧化程度的相關系數如表8所示。米飯的外觀、氣味、適口性、滋味、冷飯質地和綜合評分均與大米蛋白羰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；適口性和滋味與大米蛋白二硫鍵含量呈顯著負相關（P＜0.05）。已有研究表明，米飯的感官品質和質構特性密切相關，如：米飯的硬度與感官評價指標均呈負相關，彈性與米飯的口感、形態和色澤呈正相關[32]，因而造成米飯質構特性下降的原因也可能是感官品質劣變的關鍵因素。稻谷儲藏過程中，大米蛋白發生最為顯著的氧化修飾是游離巰基轉變為二硫鍵，一方面使大米蛋白交聯度和聚集程度增加，影響淀粉膨潤度和米飯質地；另一方面導致蒸煮米飯風味物中硫化物含量下降，影響米飯特有風味[33]。

3 結 論

‘金優207’和‘吉粳88’在加速陳化儲藏過程中，大米蛋白羰基含量持續增加，總巰基和游離巰基含量逐漸下降，表明兩種大米的蛋白氧化程度不斷增加，且‘吉粳88’大米蛋白比‘金優207’更容易氧化。米粉糊化特性、米飯質構特性和感官品質均與大米蛋白氧化程度密切相關，主要表現在：米粉峰值黏度、最終黏度、回生值和米飯硬度與大米蛋白羰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與總巰基和游離巰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01）；米飯的咀嚼性、彈性、外觀、氣味、適口性、滋味、冷飯質地均與大米蛋白羰基含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與總巰基含量和游離巰基含量呈極顯著正相關（P＜0.01）；米粉最低黏度、米飯硬度與大米蛋白二硫鍵含量呈極顯著正相關（P＜0.01），而米飯黏聚性、回復性和黏著性等則與大米蛋白二硫鍵含量呈極顯著負相關（P＜0.01）。這表明大米加速陳化儲藏過程中，隨著蛋白質氧化程度的增加，大米老化回生程度增加，米飯質構特性和感官品質明顯下降。此外，通過對兩種大米的蒸煮食用品質進行感官評價分析還可以看出，新收獲的粳稻品種‘吉粳88’大米的各項指標均優于秈稻品種‘金優207’，但儲藏后期，‘金優207’的各項指標則逐漸優于‘吉粳88’，這表明相比于‘金優207’，‘吉粳88’在儲藏過程中感官品質劣變程度更大。