飼養方式對蘇尼特羊肌內脂肪沉積途徑AMPK-ACC-CPT1通路和肉品品質的影響

袁 倩，王 宇，蘇 琳，羅玉龍，蘇日娜，趙麗華，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

蘇尼特羊肉具有蛋白質和礦物質等營養成分含量高、脂肪酸分布合理等諸多優點[1]。傳統放牧蘇尼特羊因其肉質鮮美備受關注，近些年由于草場環境惡化導致其肉質下降。因此，尋找能夠改善肉品品質的飼養方式和其他改善途徑迫在眉睫。我國綿羊飼養方式主要有舍飼飼養、放牧加舍飼育肥飼養、放牧飼養3 種方式。如果從羊肉的風味和蛋白質、還原糖、礦物質等營養成分含量來考慮，放牧飼養一般優于舍飼飼養[2]。但是，過度放牧使草場條件變差，從而使育肥效果變差、出欄時間加長、羊肉產量減少，降低了經濟效益[3]。而放牧結合舍飼飼養則可通過人工營養搭配，調控肌內脂肪（intramuscular fat，IMF）含量。營養水平對IMF含量的影響最為明顯，營養水平高能增加肌內脂肪沉積水平，適當含量的肌內脂肪使肉的橫切面呈大理石狀，可以使肉柔軟多汁、口感細嫩，并且可以改善肉及肉制品的保水性、嫩度、風味和質地[4]。吉帥等的研究表明，舍飼和半舍飼飼養可以降低羊肉膻味，其在改變羊肉感官品質的同時可以產生較好的嫩度和脂肪香味[5]。還有研究表明在放牧飼養條件下，動物可以從牧草中攝入較多的維生素（VA、VC、VE等）和多不飽和脂肪酸，以及具有抗氧化活性的礦物質等，從而影響肉品品質[6]。Akin等在不同飼養方式對Damascus羊胴體品質和肉品品質影響的研究中指出，羊所食牧草和飼料中VE含量不同導致羊肉脂肪抗氧化性能不同，進而導致肉品品質不同[7]。Priolo等的研究表明舍飼飼養羊肌肉更加柔軟多汁，其保水性更好[8]。

一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以通過調節動物糖代謝、脂代謝和蛋白質代謝等機體代謝影響肉品品質[9-13]。目前為止，關于AMPK表達對肉品品質影響的研究大多集中在糖代謝途徑中。馬曉冰研究了飼養方式對宰后蘇尼特羊肉AMPK、糖酵解及肉品品質的影響，結果表明AMPK活化后能夠提高己糖激酶的活力，加速糖酵解進程，導致乳酸含量增加。乳酸含量是影響宰后肌肉pH值的重要因素，進而會影響羊肉品質[14]。AMPK通過對脂肪代謝的調控來影響肉品品質，其主要是通過調控脂肪代謝相關基因和酶的表達影響肌內脂肪沉積來實現的，目前對這方面的研究較少。飲食、運動、溫度等因素都可以激活AMPK，活化的AMPK抑制乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC），導致丙二酸單酰輔酶A含量減少，減弱了對肉毒堿脂酰轉移酶1（carnitine palmitoyltransferase，CPT1）的抑制作用，促進脂肪酸進入線粒體進行氧化分解[13,15]，從而使脂肪沉積減少、嫩度降低，進而影響肉品品質。因此，本實驗就不同飼養方式對AMPK-ACC-CPT1信號通路的影響進行研究，進而研究AMPK在蛋白水平和基因水平對脂肪代謝的調節、IMF含量及肉品品質的影響，旨在為通過調控AMPK活力改善肉品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

12 月齡健康無病放牧和舍飼飼養蘇尼特羊各12 只，公母各半，由內蒙古烏拉特中旗育種園區提供。

RNAiso Plus試劑、Premix Taq Version2.0（loading dye mix）預混液、PrimeScript RT reagent試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II試劑盒、6×loading buffer、Marker DL2000 大連寶生物工程有限公司；RNase-free水北京天根生物技術有限責任公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 美國Intrivogen公司；核酸染料 北京百泰克生物技術有限公司；綿羊AMPK酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、綿羊ACC ELISA試劑盒、綿羊CPT1 ELISA試劑盒、綿羊p-AMPK ELISA試劑盒、綿羊p-ACC ELISA試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京eBio-top技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1112C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；5430R低溫臺式冷凍離心機、移液槍 德國Eppendorf公司；BG-power5000型穩壓穩流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像系統、CFX96實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；普通PCR儀 美國AB公司；H2500R-2高速冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；pH-STAR型胴體直測式pH計德國MATTHAUS公司；制冰機 寧波格蘭特制冷設備制造有限公司；快速混勻儀 常州國華電器有限公司；C-LM3B型數顯式肌肉嫩度儀 東北農業大學工程學院；TC-P2A全自動測色色差計 北京奧依克光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取12 月齡健康無病放牧和舍飼飼養蘇尼特羊各12 只，公母各半。放牧飼養組羊白天放牧，晚上不予補飼，牧草種類主要以烏拉特中旗荒漠化草原典型牧草（包括芨芨草、蒙古蔥、中間錦雞兒、沙生冰草、堿韭等10余種）為主。舍飼飼養組羊模擬內蒙古限牧政策下的飼養模式，即前9 個月同放牧飼養組，后3 個月舍飼育肥。育肥階段食用農區飼草料（玉米秸稈、葵盤粉、葵花籽皮等，同時補充玉米精料）。兩組實驗羊在共同放牧9 個月后平均體質量大致相同。12 個月宰后選取股二頭肌，一部分進行肉品品質測定，另一部分分割成小塊放入凍存管后投入液氮速凍，在－80 ℃冰箱保存，待測定酶活力和質量濃度以及相關基因mRNA表達量時使用。

1.3.2 AMPK、ACC、CPT1的活力與質量濃度的測定

酶的提?。涸?0 mL的離心管中加入2.7 mL冰凍的PBS，取冰凍的肌肉樣品0.3 g（冰凍肌肉在－80 ℃保存）。在3 000 r/min下冰浴勻漿，每個樣品勻漿2～3 次，每次1 min，然后將勻漿后的樣品在4 ℃、4 000 r/min下離心15 min，將上清液分裝入1.5 mL離心管待測定時使用。

酶活力和質量濃度的測定（以AMPK為例）：采用生物素雙抗體夾心ELISA法測定樣品中AMPK的質量濃度。向預先包被了AMPK單克隆抗體的酶標孔中加入AMPK，溫育后加入生物素標記的抗AMPK抗體，再與鏈酶親和素-過氧化物酶結合，形成免疫復合物，經過溫育和洗滌去除未結合的酶，然后加入試劑盒中底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下最終轉化成黃色，其顏色深淺與樣品中AMPK的質量濃度呈正相關。ACC、CPT1、p-AMPK、p-ACC質量濃度的測定方法同上。

測定流程為：準備試劑、樣品和標準品→加入準備好的樣品和標準品，37 ℃反應90 min→洗板2 次，加入生物素抗體工作液，37 ℃反應60 min→洗板3 次，加入親和素-過氧化物酶復合工作液，37 ℃反應30 min→洗板5 次，加入TMB顯色工作液，37 ℃避光反應30 min→加入TMB終止液→30 min之內讀取OD值→計算樣品和標準品待測因子質量濃度。

1.3.3 實時熒光定量PCR測定

采用TRIzol法提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠法和紫外-分光光度計檢測總RNA的完整性和質量濃度。cDNA采用反轉錄試劑盒制備，置于－20 ℃保存待用。目的基因和管家基因的引物參照NCBI中提供的序列進行設計（表1）。實時熒光定量PCR程序為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35 個循環；72 ℃、10 min，4 ℃、24 h。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書中CFX96實時熒光定量PCR儀步驟操作。以AMPKα1、AMPKα2、ACC和CPT1作為實驗基因，18S RNA作為管家基因，分別做3 個平行。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table1 Primers used for relative quantif i cation by real time PCR

1.3.4 肉品品質的測定

動物屠宰前禁食12 h、禁水2 h，屠宰后選擇股二頭肌進行肉品品質測定。pH值利用pH-STAR型胴體直測式pH計測定。在宰后45 min時測定初始pH值，記作pH0，靜置排酸24 h時測定最終pH值，記作pH24[16]。將肉樣修整成3 cm×3 cm×1 cm的形狀，使用TC-P2A全自動測色色差儀測定肉品顏色[17]，結果分別用亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）表示。將肉樣修整成2.5 cm×3 cm×5 cm大小的肉塊，密封后置于75 ℃水浴鍋中煮45 min，取出后待肉塊變涼，順著肌纖維方向將肉塊修成大小為3 cm×1 cm×1 cm的條狀，測定剪切力以表征其嫩度[18]。稱取肉樣30.0～50.0 g置于沸水中煮45 min，取出后置于室溫自然冷卻30～40 min，瀝干水分再次稱質量，以煮后質量與煮前質量比值的百分數表示熟肉率。IMF含量的測定采用索氏抽提法[19]。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 飼養方式對AMPK-ACC-CPT1通路相關酶質量濃度和活力的影響

p-AMPK質量濃度代表AMPK的磷酸化程度，p-AMPK質量濃度/AMPK質量濃度表示AMPK的活力，其值越大表示AMPK活力越高；相似地，p-ACC質量濃度代表ACC的磷酸化程度，p-ACC質量濃度/ACC質量濃度代表ACC活力的倒數，其值越大表示ACC活力越低[20]。

圖1 飼養方式對AMPK-ACC-CPT1通路相關酶質量濃度（A）和酶活力（B）的影響Fig.1 Effects of feeding systems on enzyme concentrations （A） and activities （B） related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由圖1可知，放牧飼養組股二頭肌的AMPK質量濃度、AMPK活力和CPT1質量濃度顯著高于舍飼飼養組，ACC活力顯著小于舍飼飼養組（P＜0.05），而二者ACC質量濃度差異不顯著（P＞0.05）。Kido等的研究表明，運動使p-AMPKα蛋白表達與磷酸化水平和p-ACC蛋白表達水平顯著增加，表示運動在蛋白水平上可以顯著增加AMPK-ACC信號轉導通路的表達[21]，這與本研究結果一致。Yook等[22]對小鼠的實驗和Granlund等[23]對豬的實驗均證明運動在蛋白水平上可以激活AMPK，增加AMPK蛋白表達量。由于放牧飼養羊的運動量遠多于舍飼飼養羊，所以放牧飼養條件下其股二頭肌的AMPK質量濃度顯著高于舍飼飼養。除此之外，也有研究表明放牧飼養羊所食牧草中不飽和脂肪酸含量較舍飼飼養組高，不飽和脂肪酸也有激活AMPK、促進AMPK表達的作用[24-25]。AMPK的激活對ACC的表達有抑制作用，ACC被抑制后會釋放CPT1攜帶長鏈脂肪酸進入細胞膜，進而促進脂肪酸β氧化，從而減少脂肪沉積[26-27]。

2.2 飼養方式對AMPK-ACC-CPT1通路相關基因mRNA表達量的影響

2.2.1 總RNA提取結果

圖2 總RNA提取結果Fig.2 Electrophoresis of total RNA

由圖2可知，28S、18S處條帶清晰明亮，總RNA完整無降解。經紫外分光光度計檢測其吸光度均在1.8～2.1之間，可知RNA純度高，可用于后續反轉錄實驗。

2.2.2 AMPK-ACC-CPT1通路相關基因mRNA表達量測定結果

表2 飼養方式對AMPK-ACC-CPT1通路相關基因mRNA表達量的影響Table2 Effects of feeding systems on mRNA expression of genes related to the AMPK-ACC-CPT1 pathway

由表2可知，放牧飼養組AMPKα2 mRNA表達量顯著大于舍飼飼養組（P＜0.05），而ACC mRNA表達量顯著小于舍飼飼養組（P＜0.05），AMPKα1、CPT1 mRNA表達量在兩種飼養方式間無顯著差異。張凱杰的研究表明，抗阻運動訓練可以增加AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達量[28]。梁俊芳在基因敲除對小鼠骨骼肌代謝的研究中發現，AMPKα2敲除后，AMPK活力顯著下降，AMPK-ACC通路受阻[20]。Hu Xiyi等在限制飲食對雞骨骼肌AMPK通路影響的研究中也發現，限制飲食可以激活骨骼肌AMPK，進而激活AMPK-ACC通路，且在基因水平上對調控此通路起主要作用的是AMPKα2[29]，與本研究結果一致。由此可見，在基因水平上對AMPK-ACC-CPT1通路起主要調控作用的是AMPKα2。

2.3 飼養方式對IMF含量的影響

圖3 不同飼養方式對IMF含量的影響Fig.3 Effects of feeding systems on IMF content

由圖3可知，放牧飼養蘇尼特羊肉中的IMF含量顯著低于舍飼飼養組（P＜0.05）。這可能是由于運動可以激活AMPK-ACC-CPT1通路，促進脂肪酸氧化，減少脂肪的合成。張潔等在對AMPK在機體骨骼肌運動代謝適應方面的研究中得出結論，運動可以激活AMPK[30]。AMPK-ACC-CPT1通路激活后，脂肪沉積減少。Niu Yanmei等在對改善小鼠骨骼肌胰島素抵抗的研究過程中也發現，有氧運動可以激活AMPKα-ACC-CPT1信號通路[31]。黃進寶在對茶多酚對肉雞脂肪代謝的影響的研究中得出結論，AMPK-ACC-CPT1通路被激活后可以促進脂肪酸氧化，減少脂肪合成[32]。George等的研究表明舍飼飼養羊IMF含量顯著高于放牧飼養羊[33]，與本研究結果一致。

2.4 飼養方式對肉品品質的影響

表3 飼養方式對肉品品質的影響Table3 Effects of feeding systems on meat quality

由表3可知，放牧飼養組羊股二頭肌pH24顯著低于舍飼飼養組（P＜0.05）。對于色澤來說，股二頭肌的L*值和b*值均為放牧飼養組顯著高于舍飼飼養組（P＜0.05）。肌肉亮度越低，肉表面反射的光越少，表明肉表面越干燥。Castellini[34]和張惠[35]等對草場散養肉雞肌肉品質進行研究，發現由于散養組雞肉的持水力降低，肌肉中大量水分到達肌肉表面，使得肌肉的亮度顯著增加，這與本研究結果一致。本研究中放牧飼養組羊股二頭肌黃度顯著大于舍飼飼養組，此類的相關報道較少，其機理有待進一步研究。放牧飼養組羊股二頭肌剪切力顯著大于舍飼飼養組，表明放牧飼養組羊肉嫩度顯著小于舍飼飼養組（P＜0.05），這可能是由于放牧可以在一定程度上激活AMPK，同時激活AMPK-ACC-CPT1通路，促進脂肪酸氧化，抑制脂肪沉積，使得放牧飼養組羊肉IMF含量顯著低于舍飼飼養組，由于IMF含量與嫩度呈正相關[19]，最終使放牧飼養羊肉嫩度顯著低于舍飼飼養。

3 結 論

不同飼養方式對AMPK表達具有影響，放牧飼養較舍飼飼養可以促進AMPK表達，激活AMPK-ACC-CPT1通路，減少蘇尼特羊肉脂肪沉積，進而影響其色澤、嫩度等諸多肉品品質指標。在當前草場載畜力不足的情況下，研究既能改善肉品品質又能滿足草場可持續發展要求的新型限牧養殖模式具有重大意義。與此同時，通過調控AMPK的活力改變肌內脂肪沉積水平，進而改善不同飼養方式下的肉品品質，為未來養殖提供了新思路。

放牧飼養組羊股二頭肌AMPK質量濃度、AMPK活力和CPT1質量濃度顯著高于舍飼飼養組，ACC活力顯著小于舍飼飼養組（P＜0.05），說明放牧飼養可以在蛋白水平上激活AMPK-ACC-CPT1通路。放牧飼養組羊AMPKα2 mRNA表達量顯著高于舍飼飼養組（P＜0.05），ACC mRNA表達量顯著低于舍飼飼養組（P＜0.05），說明在基因表達水平上對AMPK-ACC-CPT1通路起主要調控作用的是AMPKα2亞基。放牧飼養蘇尼特羊肉中的IMF含量顯著低于舍飼飼養組（P＜0.05），說明運動可以激活AMPK-ACC-CPT1通路，促進脂肪酸氧化，減少脂肪的合成。放牧飼養組羊股二頭肌剪切力顯著大于舍飼飼養組（P＜0.05），表明放牧飼養組羊肉嫩度小于舍飼飼養組，說明放牧飼養可以一定程度上激活AMPK，同時激活AMPK-ACC-CPT1通路，促進脂肪酸氧化，抑制脂肪沉積，進而使得放牧飼養組羊肉IMF含量顯著低于舍飼飼養組，最終使其嫩度顯著低于舍飼飼養組，影響肉品品質。