靈芝固體發酵龍眼核提取物的主要活性成分及其抗氧化性

張國廣,沈 琳,黃冰晴,賴燕華,周 梅,鄒金美

(1.閩南師范大學生物科學與技術學院,福建漳州 363000;2.菌物產業福建省高校工程研究中心,福建漳州 363000)

龍眼(DimocarpuslongyanLour)俗名桂圓,是無患子科龍眼屬植物,屬于亞熱帶果樹,在中國和東南亞一些國家,如越南、泰國、菲律賓等國廣泛栽培。在中國主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣和海南等省,云南、貴州和四川等省也有少量栽培。龍眼核是龍眼果實的種仁,其重量約占龍眼果實鮮重的17%[1],是龍眼果實加工中的主要廢棄物。

龍眼核富含淀粉和蛋白質等營養物質成分,其淀粉含量在38.5%～60%之間,蛋白質含量5.59%～7.4%,還原糖含量10.2%～14.13%,脂類含量在2.47%以上[2-3],是具有開發利用價值的生物質營養資源。龍眼核也富含多酚類、黃酮類和多糖等活性物質,其提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗蟲等生物活性[1,4-9]。很多酚類和黃酮類物質能夠賦予食用資源抗菌和抗氧化等保健功能,但該類物質也賦予了食材的苦味和澀味等,甚至部分酚類或黃酮類成分長期食用可能會有一定的毒副作用,盡管有研究對龍眼核的毒理學進行了探討,在動物飼喂試驗期內(13周)沒有觀察到龍眼核的毒性效應[10]。但因龍眼核口感澀苦,適口性較差,作為食用或飼用資源加以利用的報道并不多見[11],在局部地區作為一種中藥有少量的利用[12-13],其余多被焚燒或被丟棄,造成生物資源的浪費。用真菌發酵中草藥或工農業生產中產生的廢棄物,以改善藥物療效或提高加工廢棄物的食用或藥用價值的研究表明，真菌發酵中藥材后可以改變其活性或藥用成分,具有減毒和增加相關療效的效果[14-16],真菌發酵普通食材也可以增加其活性成分[17-18]。本研究擬探討用靈芝發酵含有龍眼核的固體基質后的主要活性成分含量變化及其抗氧化活性變化,為開發基于龍眼核的功能性食用或飼用菌質營養資源提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼核 購買自福建科人公司;高粱和小麥 購自糧食市場;靈芝菌種 學院菌物實驗室保存;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基 杭州濱和微生物試劑公司;蘆丁、齊墩果酸 標準品,中國食品藥品檢定研究院;沒食子酸 Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、3-(2-吡啶基)-5,6-雙(4-磺苯基)-1,2,4-三嗪二鈉鹽(Ferrozine) 梯希愛上?；晒?總抗氧化測定試劑盒 南京建成生物公司;其它試劑 市售分析純。

Multiskan Go全波長酶標儀 Thermo Scientific公司;AR124CN 電子分析天平 奧豪斯公司;UV-1100分光光度計 上海美譜達公司;JY99-IIDN超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝公司;TGL-20M冷凍離心機 長沙湘儀公司;PE-400S破碎機 廣州旭朗機械設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝固體發酵龍眼核 PDA培養基按照說明書配制,配制后121 ℃高壓滅菌20 min,在超凈工作臺內倒入直徑9 cm玻璃平板，制成PDA固體培養平板。超凈工作臺內從靈芝母種中挑取約1 cm見方的小塊，放置在PDA培養平板中間,28 ℃的培養箱內培養,待菌絲基本長滿平板后備用。

小麥清洗后用清水浸泡24 h,撈至沸水中煮至小麥粒中無白心,撈出攤晾至小麥粒表面無明顯水分,將小麥粒裝入500 mL玻璃瓶中，裝至瓶高三分之二處，封口后126 ℃高壓滅菌2 h,得到小麥粒固體培養基，冷涼至室溫后，在超凈臺內將長滿菌絲的靈芝菌種平板接種至小麥粒固體培養基中,一個活化的靈芝菌種平板接種一瓶小麥粒固體培養基。接種后,于28 ℃的培養箱內培養,待瓶中菌絲長滿小麥粒固體培養基后備用。

將購買的龍眼核清洗后,于鼓風干燥箱內60 ℃烘干,用破碎機破碎成直徑4 mm左右的顆粒狀,使用高粱和龍眼核顆粒兩種材料制備固體培養基,設置高粱和龍眼核的重量比分別為100∶0、70∶30、30∶70和0∶100的4種培養基,即分別包含重量百分比為0%、30%、70%和100%龍眼核的4種固體培養基,采用上述真菌麥粒菌種培養基的制作方法對兩種材料進行處理后，混合或單獨裝入500 mL玻璃瓶內，裝料至瓶高三分之二處,126 ℃高壓滅菌2 h后,取出冷涼至室溫后接入上述準備好的靈芝麥粒固體菌種,菌種接種量5%,每種培養基均同時設置不接菌對照組。

接菌組和對照組均放入28 ℃的培養箱中培養,間隔24 h觀察一次,接種菌玻璃瓶表面觀察到靈芝菌絲長滿玻璃瓶后,再繼續培養7～10 d,將接菌組玻璃瓶和對應的對照組基質瓶取出，放置到鼓風干燥箱內，60 ℃烘至徹底干燥后粉碎備用。100%龍眼核組中靈芝菌絲生長最慢,2個月左右菌絲才長滿全瓶。

1.2.2 提取物的制備 以60%乙醇為提取溶劑,采用超聲波輔助法提取1.2.1靈芝發酵所制備的固體基質和其對照組的有效成分,超聲波破碎程序設置為：破碎5 s、間歇5 s,提取30 min,超聲頻率40 Hz、超聲功率800 W,溫度60 ℃。提取物最后定量為：以發酵或未發酵的基質質量計0.1 g/mL,共計制備8種不同的提取物,為方便表述分別用字母編號表示(表1)。

表1 8種提取物的字母編號Table 1 Alphabet code of 8 kinds of extracts

1.2.3 提取物中糖、多酚類、黃酮類和總三萜含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定提取物中糖含量[19],以葡萄糖為標準品,測得的標準線性回歸方程為y=16.234x - 0.0142,R2=0.989;

采用福林酚法測定提取物中多酚類物質含量[4],以沒食子酸為標準品,測得的標準曲線回歸方程為y=1.6369x+0.0143,R2=0.9984;

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定提取物中黃酮類含量[20],以蘆丁為標準品,測得的標準曲線回歸方程為y=1.0626x+0.0082,R2=0.9946;

采用香草醛-高氯酸顯色法測定提取物中總三萜物質含量[21],以齊墩果酸為標準品,測得的標準線性方程為y=11.556x - 0.013,R2=0.9983。

1.2.4 總抗氧化能力的測定 8種接種靈芝或未接種靈芝發酵培養基提取物總抗氧化能力測定方法，按試劑盒說明書提供的方法進行,總抗氧化能力(T-AOC)定義為：在37 ℃時,每分鐘每毫升樣品液使反應體系的520 nm波長處吸光度值每增加0.01時,為一個總抗氧化能力單位(U)。

1.2.5 總還原力的測定和清除DPPH自由基能力測定 將A、B、C、D、A′、B′、C′和D′ 8種提取物分別配成濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.1 g/mL的測試液。

總還原力測定采用鐵氰化鉀還原法測定,操作步驟參照文獻[20];

DPPH自由基清除能力的測試方法參考文獻[19]步驟進行。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻[4]步驟并修改使之適用于酶標儀測定:稱取ABTS 3 mg,溶解于0.735 mL純水中;稱取過硫酸鉀1 mg,溶解于1.43 mL純水中;取0.4 mL ABTS與0.4 mL 過硫酸鉀溶液混勻,黑暗、室溫靜置12 h,取出后稀釋30倍左右,使其吸光值落在0.8左右;酶標板每5孔為一組共取兩組,依次加入0.16 mL ABTS工作液,然后在一組5孔中加入0.04 mL固體基質提取物(A),另外一組5孔中分別加入0.04 mL 60%乙醇為(A0),微型渦旋儀上輕微振蕩10 s,混勻,靜置6 min后,在酶標儀中734 nm波長下測定各孔的吸光值;按以下公式計算清除率:

1.2.7 Fe3+還原抗氧化能力的測定 采用FRAP法測定,參考文獻[4]并修改使之適用于酶標儀:由0.3 mol/L pH3.6 的乙酸鈉緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液(TPTZ溶液采用40 mmol/L HCl溶解)和20 mmol/L三氯化鐵以體積比10∶1∶1混勻,現配現用;取150 μL上述混勻FRAP試劑于酶標管中,加入15 μL 60%乙醇和5 μL不同濃度的提取物,將反應混合物在37 ℃下孵育30 min,用酶標儀于593 nm波長下測定各板孔的吸光值。吸光值越高，表明對Fe3+的還原能力越強。

1.3 數據處理

樣品測定采用3個重復。實驗結果用SPSS 17.0軟件進行統計分析,運用Origin 6.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 糖類、多酚類、黃酮類和三萜類物質測定結果

由表2可知，A、B、C、D 4種未接靈芝發酵處理的提取物中,隨著基質中龍眼核含量的增加,糖含量顯著增加(p<0.05),可能是因為龍眼核中小分子糖類含量較高粱中的多,所以在用60%乙醇提取時，溶解在溶劑中的糖類物質較多,在A′、B′、C′、D′ 4種接靈芝菌發酵基質的提取物中,糖含量均比未接菌顯著性增加(p<0.05),可能是靈芝生長過程中，能夠分解利用基質中的營養物質,在菌體構建過程中重新產生可溶解于60%乙醇中的糖類。

表2 8種提取物中幾種活性物質測定結果Table 2 Determination results of several active components in 8 kinds of extracts

A、B、C、D 4種未接菌基質的提取物中,隨基質中龍眼核含量的增加,多酚類物質含量顯著性增加(p<0.05),而在接菌的A′、B′、C′、D′ 4種基質的提取物中,除A′組外,B′、C′和D′組多酚類物質含量與對應的B、C和D組多酚類含量相比，都顯著性降低(p<0.05),可能是靈芝在其菌絲生長過程中，能分泌相應的酶，分解利用龍眼核中的大量多酚類物質。鄒禮根等[22]在用靈芝發酵綠茶中也發現,靈芝能顯著性降低茶葉中的茶多酚含量。A′組多酚類含量顯著高于未接菌的A組(p<0.05),可能是靈芝在純高粱培養基生長過程中，菌絲會產生一些多酚類物質,未接靈芝的A組中多酚類含量在8個試驗組中最低(表2)。

在8種基質中，黃酮類物質的變化趨勢和多酚類物質的變化趨勢基本一致(表2),可能在靈芝菌絲的生長過程中,能分泌某些酶，從而分解或利用龍眼核中的黃酮類物質,靈芝菌絲生長中也會在菌體內產生一些新的黃酮類物質。張平等[14]在使用靈芝發酵枇杷葉時，也發現枇杷葉的黃酮類物質顯著性下降。

未接靈芝菌的A、B、C、D 4種提取物中,總三萜含量隨基質中龍眼核含量的增加基本呈現小幅度增加趨勢(表2),在接菌的C′和D′ 2種提取物中,總三萜含量與對應的C和D組比有所下降,但差異不顯著(p>0.05),說明龍眼核自身含有三萜類物質,靈芝菌絲生長中能夠分解利用龍眼核的三萜類物質;而純高粱基質經過靈芝發酵后的A′與對照A組比,三萜類物質含量顯著性增加(p<0.05),說明靈芝菌絲體構建過程中有三萜類物質的生成[23]。

2.2 總抗氧化能力分析

由圖1可知，A、B、C、D 4種未接靈芝發酵的基質提取物，其總抗氧化活性隨基質中龍眼核含量的增加而增強,其總抗氧化活性的變化可能與其多酚類物質和黃酮類物質含量的遞增有關[4];與B、C、D提取物相比,接入靈芝發酵的B′、C′和D′ 總抗氧化能力減小,可能與靈芝對龍眼核發酵后使得基質中的多酚和黃酮類物質含量降低有關,A′組比未接菌A組的總抗氧化活力略強,可能與靈芝接種高粱后，在生長過程中產生的活性物質有關[17]。

圖1 8種不同提取物總抗氧化能力測定結果Fig.1 Determination results of total antioxidant capacity of 8 different extracts

2.3 總還原力分析

由圖2可知，8種提取物在所設定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內，隨著濃度的升高,總還原力呈上升的趨勢。三種包含30%、70%和100%龍眼核的B′、C′和D′與未發酵的B、C和D相比，總還原能力下降,可能是靈芝發酵后菌質內的酚類和黃酮類物質含量下降所致;純高粱接入靈芝發酵組A′總還原力相對A組有所提高,可能與靈芝菌絲生長中產生的具有還原能力的物質有關[17-18]。

圖2 8種不同提取物的總還原力測定結果Fig.2 Determination results of total reducing capacity of 8 different extracts

2.4 清除DPPH自由基能力比較

由圖3可知，8種提取物在所設定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內，隨著濃度的升高,DPPH自由基的清除能力呈上升的趨勢。C、D組未經過靈芝發酵的基質，其DPPH自由基清除能力較強,設定的最低濃度清除能力能夠達到80%以上,經過靈芝發酵后DPPH自由基清除能力均有下降,可能是靈芝發酵后龍眼核內的多酚類和黃酮類物質含量下降所致;A′組DPPH自由基清除能力相對A組有較大的增強,可能與靈芝菌絲生長中產生的活性物質有關[17-18]。

圖3 8種不同提取物清除DPPH自由基能力結果Fig.3 Determination results of scavenging DPPH ability of 8 different extracts

2.5 ABTS自由基清除能力的測定結果

由圖4可知，8種基質的提取物在所設定的濃度范圍0.001～0.1 g/mL內，隨著濃度的提高，ABTS自由基的清除率呈現上升的趨勢。含有相同重量百分比龍眼核的培養基質接菌培養后提取物對ABTS清除率較未接菌處理組的清除能力下降,可能與靈芝發酵后基質內多酚類和黃酮類物質含量的下降有關[24]。A′組ABTS自由基清除能力相對A組有所提高,可能與靈芝菌絲在高粱中生長產生的活性物質有關[17-18]。

圖4 8種不同提取物ABTS自由基清除能力Fig.4 Determination results of scavenging ABTS ability of 8 different extracts

2.6 Fe3+還原能力的測定結果

由圖5可知，6種包含有龍眼核的基質提取物在所設定的濃度范圍0.001～0.01 g/mL內，隨著各自濃度的升高，其Fe3+還原能力呈現上升的趨勢,不含龍眼核的A和A′組無論有無靈芝的發酵，對Fe3+還原能力均較弱;未使用靈芝發酵的B、C、D組和靈芝發酵的B′、C′、D′組相比，對Fe3+的還原能力更強。

圖5 8種不同提取物Fe3+還原能力Fig.5 Determination results of Fe3+ reduction ability of 8 different extracts

3 討論與結論

本研究中龍眼核經過靈芝固體發酵后,發酵龍眼核提取物中的糖的含量顯著性增加(p<0.05),多酚類和黃酮類物質含量較未發酵的對照組顯著性降低(p<0.05),說明靈芝生長中能夠利用或分解培養基質中的酚類物質和黃酮類物質[14-15,22],靈芝發酵中草藥的研究也表明，靈芝發酵能顯著改變中藥材中的活性成分,起到減毒增效的作用[15-16]?？寡趸芰z測結果表明，靈芝固體發酵龍眼核后的提取物仍然保持了一定的抗氧化活性,說明靈芝發酵龍眼核后產生的菌質兼具了營養和保健兩種屬性。靈芝對高粱的發酵表明，發酵后(A′組)增加了高粱的抗氧化活性,該結果也和猴頭菌[17]和靈芝[18]發酵普通食材可以增加食材的保健成分和保健效果的研究結果一致。本研究結果為龍眼核的食用或飼用資源的拓展利用提供了實驗依據。