桑葚籽黃酮超聲酶解提取工藝優化及其抗菌、抗氧化活性

曹培杰,崔 晉,馬艷弘

(1.山西農業大學食品科學與工程學院,山西太谷 030901;2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014)

桑葚又名桑葚子、桑果、桑子,是蕁麻目?？浦参锷?MorusalbaL.)的果實,含花青素、必需氨基酸、白藜蘆醇、維生素及多種微量元素,為衛生部首批藥食兩用的果品之一,具有抗菌[1-3]、抗衰老、抗腫瘤、降低膽固醇、提高免疫力等保健功能,在臨床上已用于慢性肝炎、高血壓、高血脂、糖尿病、再生障礙性貧血、胃腸道疾病、老年便秘和睡眠障礙的輔助治療[4-7],其相關產業發展已受到社會各界的廣泛關注,深加工產品在國內外市場備受青睞。桑葚果中含有豐富的營養成分,國內的加工產品有桑葚果醬、果汁飲料、桑葚果酒、桑葚果醋等。但是這些產品加工后的副產物(桑葚籽),目前僅僅用于飼料,還沒有引起農民及科學家們的充分關注與重視。

桑葚籽為桑葚果酒、果汁等產品的加工廢棄物,富含黃酮、多糖、生物堿、二苯乙烯類等活性成分[8],具有很強的生物保健功能和良好的開發應用前景。目前,有關桑葚的研究主要集中在果實花色苷、膳食纖維、多糖等方面,而關桑葚籽黃酮的提取和生物活性研究仍未見報道。桑葚籽中的黃酮,是一類對機體生命活動及其重要的次生代謝產物,此類次生代謝產物是多酚類化合物,化合物分子式中具有苯—吡喃酮的結構官能團。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類,小部分以游離態(苷元)的形式存在[9-13]。本研究采用復合酶超聲輔助提取法提取桑葚籽黃酮,考察果膠酶和纖維素酶的添加量、復合酶比例、酶解溫度、酶解時間、pH、超聲時間對黃酮得率的影響,并在單因素試驗基礎上,通過響應面分析法優化桑葚籽黃酮的提取工藝,進一步研究其抗氧化活性與抑菌活性。采用超聲波酶法輔助提取桑葚籽黃酮,因為植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠,恰當地用酶處理,可使細胞壁發生不同程度的改變,從而改變細胞壁的通透性,提高黃酮類化合物的得率,而且提取速度快、效率高、對黃酮活性的破壞小，可為進一步的工業化生產提供可靠的技術參數[14];以桑葚籽為原料提取黃酮類物質,極大地提高了桑葚資源的利用率,為桑葚加工副產物的高值化利用提供了新的技術途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚籽 句容萬山紅遍生物科技有限公司;沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和酵母菌 江蘇省農科院加工所提供;DPPH、蘆丁、槲皮素、HPD300大孔樹脂 上海源葉生物科技有限公司;羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測試盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑均為國產分析純。

DXF-04D小型高速打粉機 廣州市大祥電子機械設備有限公司;HWS-11恒溫水浴鍋 上海善志儀器設備有限公司;TGL-16B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;D-B5型紫外可見分光光度計 上海奧析科學儀器有限公司;RE-600A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;Epoch全自動酶標儀 Bio Tek公司;ZD-F12真空冷凍干燥機 SANYO公司;SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將桑葚籽清洗干凈,平鋪于桌面上,過夜,瀝干多余的水分,在60 ℃恒溫干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,過60目篩,得桑葚籽粉。取30 g桑葚籽粉,用濾紙包好后,置于抽提器中,加入150 mL石油醚于60 ℃水浴下脫脂6 h,取出濾紙包,置于60 ℃烘箱中放置2 h,得到脫脂桑葚籽粉,4 ℃冷光保存備用。

1.2.2 桑葚籽黃酮的提取 采用超聲復合酶法提取[14-15]。取1.0 g脫脂桑葚籽粉,按照1∶20 (g/mL)固液比加入體積分數為70%的乙醇溶液,用0.5 mol/L的NaOH溶液調節至一定pH,再加入果膠酶或纖維素酶(通過單因素實驗確定其適合的比例),混合均勻,然后在一定溫度下酶解一定時間。酶解結束后置于超聲波細胞破碎機中,超聲功率300 W下處理一定時間,室溫下,3500 r/min離心15 min,取上清液,濾渣再重復提取1次。合并兩次濾液,并通過旋轉蒸發儀(濃縮溫度為45 ℃,壓力為0.1 MPa)進行減壓濃縮,1 h后,得到桑葚籽黃酮粗提液,再經大孔樹脂分離純化、減壓濃縮(條件同上)，通過冷凍干燥機-50 ℃條件下冷凍12 h,得到桑葚籽黃酮提取物。

1.2.3 黃酮含量的測定 以蘆丁為標準品制作標準曲線[16]。將20 mg蘆丁標品用體積分數為95%的乙醇溶解,制成0.20 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的上述溶液至10 mL容量瓶中,加入質量分數為5% NaNO2溶液0.5 mL,搖勻后靜置6 min;再加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL,搖勻,靜置6 min;繼續加入質量分數為4% NaOH溶液4.0 mL,定容,搖勻后放置10 min,掃描得到最大吸收波長為510 nm。在此波長處測吸光度,以黃酮質量濃度(以蘆丁計)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制得到黃酮的標準曲線回歸方程為:y=9.74x-0.0053,式中:x為黃酮質量濃度(以蘆丁計)(mg/mL);y為所對應的吸光度;相關系數R2=0.9994。取桑葚籽黃酮提取液1.0 mL,據標準曲線的制作方法測定510 nm處的吸光度,根據回歸方程算出黃酮的質量濃度,再按照公式(1)計算黃酮得率:

黃酮得率(mg/g)=C×V×n/m

式(1)

式中:C為由標準曲線計算出的黃酮質量濃度(mg/mL);V為提取液總體積mL;n為稀釋倍數;m為脫脂桑葚籽粉的質量g。

1.2.4 桑葚籽黃酮提取的單因素實驗

1.2.4.1 酶添加量對桑葚籽黃酮得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,調節pH至6.0,分別加入不同量的(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)果膠酶和纖維素酶,混合均勻,然后在55 ℃條件下酶解90 min,酶解結束后置于超聲波細胞破碎機中,超聲功率300 W下處理20 min,室溫下,3500 r/min離心15 min,取上清液,濾渣再重復提取1次。合并兩次濾液,并通過旋轉蒸發儀(濃縮溫度為45 ℃,壓力為0.1 MPa)進行減壓濃縮,1 h后,得到桑葚籽黃酮粗提液,按照1.2.3的方法測定黃酮含量。

1.2.4.2 復合酶比例對桑葚籽黃銅得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,調節pH至6.0,按不同比例(1∶1、1∶2、2∶1)加入果膠酶和纖維素酶,混合均勻,以下步驟同1.2.4.1。

1.2.4.3 酶解溫度對桑葚籽黃酮得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,調節pH至6.0,按照果膠酶與纖維素酶比例為2∶1添加復合酶0.3 mg/mL,分別在不同溫度下(30、35、40、45、50、55、60 ℃)酶解90 min,以下步驟同1.2.4.1。

1.2.4.4 酶解時間對桑葚籽黃酮得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,調節pH至6.0,按照果膠酶與纖維素酶比例為2∶1添加復合酶0.3 mg/mL,在55 ℃條件下酶解不同時間(20、40、60、80、100、120 min),以下步驟同1.2.4.1。

1.2.4.5 pH對桑葚籽黃酮得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,分別調節pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,按照果膠酶與纖維素酶比例為2∶1添加復合酶0.3 mg/mL,在55 ℃條件下酶解80 min,以下步驟同1.2.4.1。

1.2.4.6 超聲時間對桑葚籽黃酮得率的影響 準確稱取脫脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,調節pH至6.0,按照果膠酶與纖維素酶比例為2∶1添加復合酶0.3 mg/mL,在55 ℃條件下酶解80 min,然后置于超聲波細胞破碎機中處理不同時間(5、10、15、20、25、30 min),以下步驟同1.2.4.1。

1.2.5 桑葚籽黃酮提取的響應面優化試驗 在單因素實驗基礎上,以2∶1的果膠酶和纖維素酶組成的復合酶的添加量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、超聲時間(X4)為試驗因素,采用 Box-Behnken響應面法優化桑葚籽黃酮的提取工藝條件[17]。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 黃酮的抗氧化活性測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力測定 取凍干后的桑葚籽黃酮粉末,配制成5.0 mg/mL的總黃酮溶液,并用70%乙醇稀釋成不同濃度(0.05、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL),分別移取0.1 mL稀釋液至96孔板中,每個濃度做三次平行,分別加入0.05 mg/mL DPPH溶液0.1 mL,混勻,于室溫下避光放置30 min,在517 nm處測吸光度A;對照組用0.1 ml 70%乙醇代替DPPH溶液,測其吸光度A1;空白組用0.1 mL 70%乙醇代替樣品,測其吸光度為A0,以同濃度的VC為對照[18-19],按照公式(2)計算DPPH自由基清除率:

式(2)

1.2.6.2 羥自由基抑制能力測定 分別取不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)的樣品溶液,根據羥自由基測定試劑盒說明書進行測定,以雙蒸水作為對照組，在550 nm處測吸光度,按照公式(3)通過計算羥自由基的清除率:

式(3)

1.2.6.3 抗超氧陰離子自由基能力測定 采用抗超氧陰離子自由基及產生超氧陰離子自由基測試試劑盒,測定桑葚籽黃酮抗超氧陰離子自由基活力。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的桑葚籽黃酮溶液,按試劑盒說明書操作,以VC標準品對照，在550 nm處測其吸光度為OD標準組，雙蒸水為空白對照，其吸光度為OD對照組。按照公式(4)計算超氧陰離子自由基清除能力:

式(4)

1.2.7 桑葚籽黃酮的抑菌實驗

1.2.7.1 菌種活化 從-70 ℃冰箱中取出供試菌株,大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和酵母菌,4 ℃條件下解凍,分別移取200 μL菌株接種于10 mL LB液體培養基中,置于37 ℃搖床中培養24 h,然后分別吸取100 μL于5 mL LB培養基中,進行二次傳代。

1.2.7.2 抑菌活性測定 將配制好的LB瓊脂培養基裝入250 mL三角瓶中,121 ℃滅菌20 min,冷至50～60 ℃,倒入直徑為9 cm的無菌培養皿中各15 mL,待其凝固后,取100 μL菌懸液均勻涂布在平板上,放入牛津杯,用移液器取不同濃度(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mg/mL)的黃酮提取液200 μL,加入牛津杯中,重復3次,以無菌水作對照[20],置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,測定抑菌圈直徑。

1.2.7.3 最小抑菌濃度(MIC)測定 將桑葚籽黃酮提取液加入50 ℃無菌LB瓊脂培養基中,混合均勻,使其在培養基中的濃度分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、3.00 mg/mL,然后倒入無菌培養皿中,凝固后,分別加入大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌菌懸液100 μL,涂布均勻[21],放入37 ℃培養箱中培養24 h,觀察是否有肉眼可見菌落。

1.3 數據處理

實驗進行3次重復操作，實驗數據采用Origin 8.5軟件進行處理并用圖表Design-Expert 8.0.6進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

不同因素對桑葚籽黃酮得率的影響效果如圖1所示。由圖1a可以看出,果膠酶和纖維素酶對黃酮得率的影響有所不同,在一定添加范圍內,隨著酶用量的增大,黃酮的提取效果明顯提高,果膠酶用量和纖維素用量為0.4 mg/mL時,黃酮得率均達到最高,分別為4.21和4.65 mg/g。繼續增加酶的用量,黃酮提取效果保持平緩甚至降低?？赡苁沁^量的酶附著在桑葚籽粉表面而影響黃酮類化合物的溶出;也可能是酶與底物充分反應后,繼續添加酶對黃酮溶出量影響不大。因此確定單一酶最佳濃度為0.4 mg/mL。

圖1 不同因素對桑葚籽黃酮得率的影響Fig.1 Effects of different factors on the yield of flavonoids from mulberry seeds

由圖1b可以看出,不同的復合酶濃度及比例對黃酮得率影響效果不同,當復合酶添加量為0.3 mg/mL,且果膠酶∶纖維素酶=2∶1時,黃酮得率最高,為5.16 mg/g,這是由于細胞壁由果膠和纖維素組成,果膠酶和纖維素酶以一定比例共同作用,能夠更好地破壞細胞壁,釋放出黃酮類物質。

由圖1c可知,當溫度低于55 ℃時,黃酮得率隨溫度的升高而增大,55 ℃時,黃酮得率達到峰值5.12 mg/g,當溫度大于55 ℃后,黃酮得率呈下降趨勢。繼續升溫反而會降低,表明當酶解溫度低于55 ℃時,隨著溫度的升高,酶活性升高,黃酮分子熱運動增強,所以得率也隨之提高;但溫度過高會使得酶蛋白變性,酶活性降低,還會使得一些醇溶性雜質快速溶解,干擾黃酮浸出速率,還有可能引起黃酮類物質結構被氧化破壞,從而導致黃酮得率降低。因此選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

如圖1d所示,隨著酶解時間的延長,黃酮得率逐漸提高,當酶解時間為80 min時,黃酮得率達到4.97 mg/g。當酶解時間超過80 min后,黃酮得率趨于平緩。表明充足的提取時間可以使底物和酶充分接觸,從而提高提取效率,但是當黃酮的溶出基本達到平衡后,即便延長時間,提取量也不會發生變化。因此,確定最佳提取時間為80 min。

如圖1e所示,溶液的pH會影響酶的活性,在微酸性環境下,酶的活性較高。pH小于5.0時,隨著pH的增大,黃酮提取率增加,當pH達到5.0時,黃酮得率達到最大值4.62 mg/g,隨后逐漸降低。這是由于不適宜的pH能影響到酶的構象和底物的解離狀態,從而導致酶活以及提取效率的降低。由此確定最佳pH為5.0。

如圖1f所示,隨著時間的延長,黃酮得率逐漸增加,20 min以后,黃酮得率逐漸趨于平緩,這是由于隨著時間的延長,超聲的機械振動和空化作用導致了桑葚籽細胞壁的破壞,被提取物的分子運動速度加快,從而導致了得率提高。但是超聲時間過長可能會與氧氣接觸或雜質增多,從而導致黃酮得率變化不明顯。因此選擇20 min為最適超聲時間。

2.2 響應面試驗結果分析

表2 響應面設計及試驗結果Table 2 Response surface design and experimental results

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

超聲波酶法提取桑葚籽黃酮的等高線和響應面見圖2～圖5,等高線可直觀地反映各因素對黃酮提取效果的交互作用程度,等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[22-23]。響應曲面圖中的曲面的陡峭程度可以表明變量對黃酮得率的影響程度,曲面較陡峭表明影響較大,反之則較小。復合酶添加量和酶解時間、復合酶添加量和酶解溫度、酶解時間和酶解溫度及超聲時間和酶解時間的交互作用的等高線均呈現橢圓、扁平狀,由此可知上述因素之間的相互作用顯著。

圖2 酶添加量和酶解溫度交互作用的等高線和響應面圖Fig.2 Contours and response surface plots of enzyme interactions and enzymatic temperature

圖3 酶添加量和酶解時間交互作用的等高線和響應面圖Fig.3 Contours and response surface plots of enzyme interactions and enzymolysis time

圖4 酶解溫度和酶解時間交互作用的等高線和響應面圖Fig.4 Contours and response surface plots of the interaction between enzymatic temperature and enzymolysis time

圖5 超聲時間和酶解時間交互作用的等高線和響應面圖Fig.5 Contours and response surface diagrams for the interaction of ultrasonic time and enzymolysis time

根據回歸模型分析可知,超聲波酶法提取桑葚籽黃酮的最佳工藝條件為復合酶添加量0.32 mg/mL、酶解溫度55.98 ℃、酶解時間75.71 min、超聲時間22.13 min。為了操作方便,修正最佳的提取條件為:復合酶添加量0.3 mg/mL、酶解溫度為55 ℃、酶解時間為80 min、超聲時間20 min,在此條件下,進行3次平行實驗,所得桑葚籽黃酮得率平均值為5.32 mg/g,實測值與預測值5.36 mg/g相對誤差僅為0.75%,因此證明實驗模型合理,實驗結果理想。

2.3 黃酮抗氧化活性

2.3.1 桑葚籽黃酮對DPPH自由基的清除作用 對桑葚籽黃酮清除DPPH自由基的能力進行研究,結果如圖6A所示,當樣品濃度在0.20～1.00 mg/mL范圍內時,桑葚籽黃酮對DPPH自由基的清除能力遠低于蘆丁和維生素C;當濃度大于1.00 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除能力與蘆丁較接近;當維生素C濃度達到1.50 mg/mL時清除效果已達到94.7%,相同條件下,黃酮對DPPH自由基的清除率為89.58%。桑葚籽黃酮對DPPH自由基有顯著的清除作用(p<0.05),而且其清除能力隨著樣品濃度的增加而增大,當濃度值達到一定值后趨于平緩。

圖6 黃酮的體外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of flavonoids in vitro

2.3.2 桑葚籽黃酮對羥自由基的抑制作用 如圖6 B所示,當樣品濃度低于0.6 mg/mL，蘆丁對羥自由基的清除能力始終高于維生素C和黃酮；當濃度高于0.8 mg/mL時，維生素C的抑制作用增強，粗黃酮與蘆丁的抑制作用接近；當樣品濃度達1.20 mg/mL時,維生素C、蘆丁和黃酮對羥自由基的抑制率分別為92.67%、90.05%和88.75%。隨著樣品濃度的增大,桑葚籽黃酮對羥自由基的抑制作用逐漸增強,且始終與蘆丁和維生素C較接近。

2.3.3 對超氧陰離子自由基的清除作用 如圖6C所示,三種溶液對超氧陰離子的清除效果區別明顯,蘆丁的清除作用最強,維生素C次之,粗黃酮最弱,但與維生素C較接近。當濃度為0.50 mg/mL時,蘆丁的抗超氧陰離子活力單位已達到225 U/L,此時,粗黃酮的僅為76.02 U/L,隨著濃度的增大,清除超氧陰離子的能力逐漸增強,最終達到258.88 U/L,所以,黃酮的抗氧化能力隨著樣品濃度的增大而增強。

2.4 黃酮的抑菌活性

2.4.1 不同濃度桑葚籽黃酮的抑菌效果 由表4可知,桑葚籽黃酮對4種菌株的生長均有一定程度的抑制作用,且抑制作用的大小與黃酮濃度呈明顯的劑量關系[24],黃酮濃度越高,抑菌圈直徑越大,且黃酮對沙門氏菌的抑制效果最為明顯,抑菌能力強弱排序為:沙門氏菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>酵母菌。

表4 桑葚籽黃酮提取液的抑菌效果Table 4 Bacteriostasis effect of flavonoids extracted from mulberry seed

2.4.2 桑葚籽黃酮MIC的測定 觀察8個不同濃度的桑葚籽黃酮溶液對4種試驗菌株的最低抑菌濃度,結果如表5所示,其對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的MIC分別為0.75、1.50、1.00、2.00 mg/mL,從表5還可以看出:黃酮濃度越高,菌落生長越少。

表5 桑葚籽黃酮的最小抑制濃度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of flavonoids from mulberry seeds

3 結論

利用Box-Benhnken響應面分析法得到桑葚籽黃酮的最優提取條件為酶添加量0.3 mg/mL、酶解溫度為55 ℃、酶解時間為80 min、超聲時間20 min。在此條件下桑葚籽黃酮得率為5.32 mg/g,比酶法提取法提高19.7%。在一定程度上減少試劑用量,節約能耗,為桑葚籽黃酮提取開發利用方面提供理論依據。另外,所得的桑葚籽黃酮對DPPH自由基、羥自由基的清除作用隨著其含量的增加而增強,且抗超氧陰離子自由基的活力也逐漸增強,表現出良好的抗氧化活性,可作為一種天然的抗氧化劑,為桑葚籽黃酮的綜合開發利用提供理論依據。通過牛津杯法檢測桑葚籽黃酮對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和酵母菌的抑菌能力大小為:沙門氏菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>酵母菌,MIC分別為沙門氏菌0.75 mg/mL、大腸桿菌1.50 mg/mL、金黃色葡萄球菌1.00 mg/mL、酵母菌2.00 mg/mL。