甘草甜味素的化學成分研究

張航航,葛振紅,李國柱,賈 旭,孟慶艷,2,*,劉文杰,2,*

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室,新疆阿拉爾 843300;3.第一師阿拉爾市食品藥品檢驗所,新疆阿拉爾 843300)

甘草甜味素是一類天然甜味劑,主要包括甘草酸、甘草素、甘草苷等化合物,甜度比蔗糖高50～300倍。甘草甜味素作為食品添加劑,具有溶解性好,低熱量,耐熱性好,溶血性低,安全無毒的特點,適合于高血壓、糖尿病患者使用,并具有一定的醫療保健功效[1]。甘草甜味素能滿足食品工業中對甜味劑的要求,在飲料中添加,可避免添加多糖引起的酸敗、發酵等變化[2]。在口香糖中添加,對口腔具有抗炎清潔殺菌效果。高級香煙中添加可作為煙草的甜潤,增香劑和保濕劑。甘草甜味素作為增香劑和風味增強劑,是天然綠色提取物,并賦予食品防病抗病的功能[3]。由于甘草甜味素具有親水、親油性,能與高級脂肪酸、甘油等日用化學品起乳化作用,因此甘草甜味素也被用做化妝品的功效成分,具有美白、抗炎、洗滌去污的作用[4]。甘草甜味素是一類混合物,必需明確其化學成分,為拓寬其應用提供理論基礎。

天然產物研究中常用的分離純化方法有柱色譜法、高速逆流色譜法等。但對于植物很多保留時間相近的化合物很難從復雜的體系中分離得到。因此,循環制備液相色譜是通過連續的循環操作方式實現模擬長柱的色譜分離效果,獲得比傳統長色譜柱更好的分離效率。循環制備液相色譜根據循環方式不同分為直接循環液相色譜、交替循環液相色譜、直接循環和交替循環相結合的制備液相色譜。直接循環由一根色譜柱和一個切換閥組成,通過控制閥的切換將溶劑和分離組分循環輸入同一色譜柱中進行重復分離,來實現化合物的分離純化。Sidana等[5]利用直接循環液相色譜分離出松三糖,其純度達到94.7%。關穎麗等[6]利用雙柱交替循環制備分離純化朝鮮白頭翁中三萜皂苷結構相似的化合物。李國柱等[7]利用直接循環和交替循環相結合的制備液相色譜從芳香新塔花中分離出結構相似化合物其純度達到96.5%。本實驗對甘草甜味素中的化學成分進行分離和結構鑒定。采用溶劑提取、中壓制備液相色譜、制備液相色譜和循環柱色譜法對甘草甜味素進行分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草甜味素 是生產甘草酸后的副產品,取自于新疆阿拉爾新農甘草產業有限責任公司;甲醇 色譜級,美國Sigma公司;超純水系統 美國Millipore公司;甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯等 天津市致遠化學試劑有限公司,均為分析純試劑。

KQ-300DE 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000B旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;島津LC-20AT型高效液相色譜儀(包括SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT泵、Lab Solutions 色譜工作站) 日本島津公司;中壓制備液相色譜系統 瑞士步琦有限公司;Waters制備液相色譜儀(Waters 2489紫外檢測器,Waters 2545二元高壓梯度泵)美國Waters公司;核磁共振儀500 MHz 瑞士bruker公司;STI 501 型液相色譜儀 杭州賽智科技有限公司;H-Class/Xevo TQD高效液相色譜儀串聯三重四級桿質譜儀(ESI源)美國Waters公司;Waters Xbridge C18(250 mm×19 mm,10 μm),2根;Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 化學成分的提取 稱取甘草甜味素200 g置于1 L的燒杯中,加入500 mL無水乙醇,用玻璃棒攪拌溶解保鮮膜封口放置過夜。將不溶于乙醇的物質置于干燥箱中烘干得餾分(A)150 g,將溶于乙醇的有機物旋干得餾分(B)50 g備用。稱取餾分(A)20 g與硅藻土按1∶1的比例,置于研缽中拌勻,裝入中壓柱色譜系統,以甲醇-水(10∶90、30∶70、60∶40)和甲醇梯度洗脫,流速為15 mL/min,每段洗脫三個柱體積,將餾分(A)分為四段(Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd)。稱取餾分(B)20 g,與硅藻土按1∶1的比例,置于研缽中拌勻,裝入中壓柱,以甲醇-水(10∶90、30∶70、60∶40、80∶20)和甲醇梯度洗脫,流速為15 mL/min,每段洗脫三個柱體積,分為五段(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe)。稱取干燥的Ⅰa 10 g與硅藻土按1∶1的比例,置于研缽中拌勻,裝入中壓柱,以甲醇-水(5∶95、20∶80、50∶50)和甲醇梯度洗脫,流速為15 mL/min,將Ⅰa分為四段(Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc、Ⅲd)。將各段餾分旋干后經HPLC檢測,甘草甜味素的主要成分在Ⅰc段的分離度很低,運用循環制備分離。其他的主成分的分離度較好,利用高效液相制備色譜進行分離。

1.2.2 HPLC分離 利用高效液相制備色譜,以甲醇和水為流動相,粗提物Ⅱa、Ⅱc進行分離。流速為15 mL/min條件下分離。其他組分段中經HPLC檢測,組分含量較少,并非是甘草甜味素中的主成分,因此,無需進行分離?；衔颕為Ⅲa中組分,以色譜條件(0～20 min 10%甲醇)等度洗脫制備,得到化合物I(19 mg);化合物IV、V、VI、VII、VIII、IX、X為甲醇-水Ⅱc(60∶40)組分,以色譜條件(0～50 min 45%～70%甲醇;50～60 min 70%甲醇)梯度洗脫制備,分別得到化合物IV(33 mg),化合物V(15 mg);化合物VI(24 mg)、化合物VII(26 mg)、化合物VIII(14 mg)、化合物IX(132 mg)、化合物X(12 mg)。

1.2.3 循環HPLC分離 稱取組分Ⅰc 150 mg,用3 mL蒸餾水溶解,配制成50 mg/mL樣品備用。經循環HPLC(40%甲醇)制備得到化合物II(31 mg)、化合物III(39 mg)。

2 結果與分析

化合物I:白色針晶(甲醇),UV λmax:208,252 nm;ESI-MS m/z:137.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.73(2H,d,J=8 Hz),6.79(2H,d,J=12 Hz),7.71(1H,S),7.04(1H,S);其1H NMR 及13C NMR 數據(表1)與文獻[8]報道基本一致,故鑒定化合物為對羥基苯甲酸(p-hydroxybenic acid)。

化合物II:白色針晶(甲醇),UV λmax:276,311 nm;ESI-MS m/z:579.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:2.70(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz),3.08(1H,dd,J=12.0,8.8 Hz),3.30-3.98(12H,m),4.97(1H,d,J=7.2 Hz),5.50(1H,d,J=12 Hz),5.53(1H,dd,J=12.0,3.0 Hz),6.36(1H,d,J=2.0 Hz),6.48(1H,dd,J=8.8,2.0 Hz),7.06(1H,d,J=8.0 Hz),7.48(1H,d,J=8.8 Hz),7.66(1H,d,J=8.8 Hz);其1H NMR 及13C NMR 數據(表1)與文獻[9]報道基本一致,故鑒定化合物為甘草素-7,4′-二葡萄糖苷(Liquiritigenin-7,4′-diglucoside)。

表1 化合物I～X的碳譜數據(500 MHz,DMSO-d6,CD3OD,δ)Table 1 13C NMR Data of compounds I～X(500 MHz,DMSO-d6,CD3OD,δ)

化合物III:白色結晶(甲醇),UV λmax:276,311 nm;ESI-MS m/z:578.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.66(1H,d,J=3.6 Hz,H-5),7.40(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),7.05(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,5′),6.53(1H,dd,J=1.2,7.6 Hz,H-6),5.50(1H,dd,J=2,10.8 Hz,H-2)5.36(IH,b.rs H-1),4.97(1H,d,J=7.2 Hz glc-H-1),3.17(1H,dd,J=8.8,10.4 Hz,H-3-trans),2.69(1H,dd,J=2.4,14.4 Hz,H-3-cis)。其1H NMR 及13C NMR 數據(表1)與文獻[10]報道基本一致,故鑒定化合物為甘草素-4-O-芹糖基-(1→2)葡萄糖苷(liquiritigenin-apiosyl(1→2)glucoside)。

化合物IV:黃色粉末(甲醇),UV λmax:362 nm;ESI-MS m/z:549.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:5.06(1H,d,J=4 Hz,葡萄糖H-1),5.37(1H,d,J=1.6 Hz,芹糖H-1),6.28(1H,d,J=4 Hz,H-3′),6.42(1H,dd,J=4,4 Hz,H-5′),7.09(2H,d,J=8 Hz,H-3,5),7.79(1H,d,J=16 Hz,H-a),7.87(2H,d,J=8 Hz,H-2,6),7.89(1H,d,J=8 Hz,H-β),8.17(1H,d,J=8 Hz,H-6′)。其1H NMR 及13C NMR數據(表1)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物為異甘草素葡萄糖芹菜苷(Licuraside)。

化合物V:黃色粉末(甲醇),UV λmax:361 nm;ESI-MS m/z:417.1[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:5.05(1H,d,J=8 Hz,芹糖H-1),6.26(IH,d,J=4 Hz,H-3,),6.41(IH,dd,J=8,4 Hz,H-5′),7.14(IH,d,J=8.8,4.0 Hz,H-3,5),7.79(IH,d,J=15.2 Hz,H-a),7.88(2H,dd,J=8.8,5 Hz,H-2,6),7.81(IH,d,J=8.8 Hz,H-β),5.13(IH,d,J=9.2 Hz,H-6′);其1H NMR 及13C NMR 數據(表1)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物為異甘草苷(Isoliquiritin)。

化合物VI:無色針晶(甲醇),UV λmax:361 nm;ESI-MS m/z:254.9[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:2.66(1H,dd,J=4 Hz,H-3),3.12(1H,dd,J=16,4 Hz,H-3),5.45(1H,dd,J=0.8,0.8 Hz,H-2),6.35(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.53(1H,dd,J=8.8,2.2 Hz,H-6),6.82(2H,d,J=8 Hz,H-3′,5′),7.34(2H,d,J=8.0 Hz,H-2,6),7.67(1H,d,J=8 Hz,5-H);其1H NMR及13C NMR 數據(表1)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物為甘草素(Liquiritigenin)。

化合物VII:黃色粉末(甲醇),UV λmax:370 nm;ESI-MS m/z:254.9[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δH:7.75(1H,d,J=4 Hz,H-a),7.77(1H,d J=8 Hz,H-β),6.30(1H,d,J=4 Hz,H-3′),6.43(1H,dd,J=8.8,8 Hz,H-5′),8.18(1H,d,J=12 Hz,H-6′),7.77(2H,d,J=4 Hz,H-2,6),6.87(2H,d,J=12 Hz,H-3,5);其1H NMR 及13C NMR 數據(表1)與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物為異甘草素(Isoliquiritigenin)。

化合物VIII:白色針晶(甲醇),UV λmax:334 nm;ESI-MS m/z:267.2[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6)δH:3.79(3H,s,-OCH3),6.87(1H,d,J=8 Hz,H-8),6.95(1H,dd,J=8,4 Hz,H-6),7.0(2H,d,J=8 Hz,H-3′,5′),7.52(2H,d,J=8 Hz,H-2′,6′),7.97(1H,d,J=8 Hz,H-5),8.33(1H,s,H-2);其1H NMR 及13C NMR數據(表1)與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物為芒柄花素(Formononetin)。

化合物IX:白色粉末(甲醇);UV λmax(nm),247,271,311;ESI-MS m/z:417.2。[M-H]-1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δH:2.75(d,1 H,J=16.8 Hz,H-3,cis),3.05(dd,1H,J=12.7 Hz,H-3,trans),3.41～3.92(m,4 H,葡萄糖上的H),4.81(d,1H,J=7 Hz,葡萄糖H-1),5.44(dd,1 H,J=7 Hz,H-2),6.39(d,1 H,J=1.5 Hz,H-8),6.53(dd,1H,J=9 Hz,H-6),7.08(d,2H,J=9 Hz,H-3′,5′),7.38(d,2 H,J=9 Hz,H-2′,6′),7.75(d,1 H,J=9 Hz,H-5);其1H NMR及13C NMR數據(表1)與文獻[14]報道基本一致,故鑒定化合物9為甘草苷。

化合物X:橙色粉末(甲醇);UV λmax(nm)247,314,369;ESI-MS m/z:269.3[M-H]-。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δH:3.35(s,3 H,-OCH3),3.90(dd,1 H,J=8.5,2.3 Hz,H-5),4.90(d,1 H,J=2.5 Hz,H-3),6.49(d,2 H,J=8.5 Hz,H-3′5′),6.82(d,1 H,J=15.8 Hz,H-α),7.65(d,2 H,J=8.5 Hz,H-2′,H-6′),8.03(d,1 H,J=15.8 Hz,H-β);其1H NMR及13C NMR 數據(表1)與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物10為刺甘草查耳酮。

3 結論

本實驗以甘草甜味素作為研究對象,綜合運用HPLC、中壓制備色譜法、雙柱交替循環制備柱色譜對甘草甜味素中的化學成分進行分離,得到10個單體化合物,用核磁共振儀對分離出的化合物進行鑒定,通過文獻比較,確定10化合物分別是,對羥基苯甲酸(p-hydroxybenic acid)(I)、甘草素-7,4′-二葡萄糖苷(Liquiritigenin-7,4′-diglucoside)(II)、甘草素-4′-O-芹糖基-(1→2)葡萄糖苷(Liquiritigenin-apiosyl(1→2)glucoside))(III)、異甘草素葡萄糖芹菜苷(Licuraside)(IV)、異甘草苷(Isoliquiritin)(V)、甘草素(Liquiritigenin)(VI)、異甘草素(Isoliquiritigenin)(VII)、芒柄花素(Formononetin)(VIII)、甘草苷(Liquiritin)(IX)、刺甘草查爾酮(Echinatin)(X)。應用的雙柱交替循環制備柱色譜技術具有分離效率高,節省溶劑等特點。本文明確了甘草甜味素中的化學成分,為評價其生物活性和應用前景提供了科學依據。