冷浸漬過程中真核微生物與小芒森干白葡萄酒香氣成分的變化

楊 沫,劉 文,趙新節

(齊魯工業大學,山東省微生物工程重點實驗室,山東濟南 250300)

小芒森(Petit Manseng),又稱小滿勝、佩特蒙森,起源于法國阿奎坦南部比利牛斯大西洋省,果實皮較厚,顆粒較小,果穗松散,因此即使采收期較晚也不易感染病菌,其糖高達260～280 g/L,酸低至9～11 g/L,糖高酸低,更適于釀造優質的甜白葡萄酒,入口圓潤,香氣濃郁,層次感和平衡性出色。冷浸漬一般是指為了浸提果皮中的芳香物質,獲得更加優雅濃郁的香氣,對除梗破碎后的葡萄原料在一定低溫條件下浸漬的一種釀造工藝[1]。因此冷浸漬工藝不僅能增加葡萄酒色度、色調、花色苷等酚類物質的含量[2],對香氣物質含量更是有著直接影響。葡萄酒的香氣質量主要取決于酯醇等化合物的濃度及種類[3],而這些又受酵母種類、葡萄品種及發酵條件等的影響[4-6]。因此冷浸漬過程中對于葡萄酒最終品質的影響不僅有物理作用還有微生物的作用,尤其是自然條件下附著于小芒森葡萄表面的野生酵母,與葡萄果實上的真核微生物在低溫條件下的微弱的代謝有關。但是國內研究冷浸漬條件下真核微生物尤其野生酵母以及小芒森葡萄酒香氣成分變化的報道較少。徐亞男等[7]將非釀酒酵母菌株和工業菌株混合發酵赤霞珠葡萄酒,對香氣成分進行分析,但是對不同非釀酒酵母的特征香氣沒有確切的研究;何娟等對貴人香冰酒大生產過程中酵母菌群結構及動態變化進行了研究分析,發現了幾株非釀酒酵母,但是對其存在的機理及環境尚不明確[8]。本實驗主要探究在冷浸漬過程中小芒森表皮真核微生物豐度及多樣性的變化以及風味物質的變化,以期為優化小芒森葡萄酒釀造工藝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小芒森 2016年10月17日采摘于煙臺蓬萊中糧長城有限公司;釀酒酵母(EC1118)、EX果膠酶 法國Lallemand公司;亞硫酸、4-甲基2-戊醇、3,5-二硝基水楊酸、糖度計、酒精計 天津市科密歐化學試劑有限公司;四甲基二戊醇 美國Aldrich公司。

自動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、7890B氣相色譜-5977A型質譜聯用儀 美國Supelco公司;5L玻璃發酵罐 四川蜀玻有限公司;DB-WAX毛細管柱 美國J&W公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小芒森干白葡萄酒釀造工藝 將10 kg小芒森葡萄(19 °Brix)除梗破碎,葡萄醪放置恒溫箱并且控制溫度4 ℃,分別帶皮浸漬1、3、5 d,每個處理浸漬結束后取樣(三個處理以下均用F1、F2、F3表示),浸漬結束后的葡萄醪進行壓榨(皮渣分離),將分離的葡萄汁澄清24 h,按照60 mg/L添加亞硫酸,添加酵母(0.25 g/L)后于18～20 ℃發酵,約15 d后發酵結束后澄清,取樣待測香氣物質。

1.2.2 基本指標測定方法 葡萄酒基本成分理化指標檢測嚴格按照國家標準GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行檢測。主要包括糖度、酒精度、總酸、還原糖、揮發酸等指標。糖度使用糖度計測定;酒精度使用酒精計測定;總酸采用電位滴定法測定;還原糖采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定；揮發酸采用蒸餾-滴定法測定。

1.2.3 微生物分析 對冷浸漬1、3、5 d分別取樣50 mL,送華大基因檢測樣品中真核微生物含野生酵母菌、真菌、霉菌等的種類及豐度(DNA樣品被接收后,對樣品進行檢測;檢測合格的樣品構建文庫:回收目的Amplicon片段,用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的粘性末端修復成平末端,再通過3′ 端加堿基“A”,使得DNA片段能與3′ 端帶有“T”堿基的特殊接頭連接;或者設計合成含有測序接頭的雙Index融合引物,以基因組DNA為模板,進行融合引物PCR,磁珠篩選目的Amplicon片段,最后,用合格的文庫進行cluster制備和測序)。

1.2.4 揮發性成分分析 發酵結束后的葡萄酒樣品用頂空固相微萃取(Headspace-solid-phase-microextraction HS-SPME)方法預處理[9],萃取頭為 50/30 μmDVB/CAR/PDMS(Supelco)。用移液器取 4990 μL樣品放入15 mL萃取瓶中,加入20 μL 4-甲基2-戊醇做為內標,加入2 g氯化鈉。萃取瓶置于固相微萃取工作臺上,35 ℃預熱10 min,磁力攪拌速度為100 r/min。將固相微萃針插入萃取瓶,推出萃取頭頂空萃取30 min。當樣品萃取達到平衡后,縮回萃取頭,迅速將萃取針插入氣相色譜儀的進樣口,推出萃取頭同時啟動氣相色譜儀采集數據,高溫解析5 min后將萃取頭縮回,拔出。色譜柱升溫程序如下:40 ℃保持8 min,以5 ℃/min升至70 ℃,保持3 min。以5 ℃/min升至230 ℃,保持2 min。進樣器250 ℃,檢測器220 ℃,無分流進樣。EI離子轟擊,電子能量70 eV;離子源溫度200 ℃;全掃描模式。

1.2.5 揮發性成分的定性與定量分析 定性分析:分析結果運用計算機譜庫(NIST11)進行初步檢索和分析,再結合文獻進行人工譜圖解析,確定揮發性物質的各個化學成分。定量分析:采用內標法進行定量分析,計算結果為兩年的平均值。計算公式如下:香氣各組分的含量(μg·g)=[各組分的峰面積/內標的峰面積×內標濃度(μg·m L)×1000]/樣品量(g)

1.2.6 數據處理 采用SPSS 19.0進行數據分析,多組間比較采用One-WayANOVA法。

2 結果與分析

2.1 冷浸漬時間對小芒森葡萄酒基本指標的影響

小芒森冷浸漬1、3、5 d處理發酵結束后葡萄酒基本指標如表1所示。與冷浸漬1 d與冷浸漬3 d相比,冷浸漬5 d的小芒森葡萄酒的酒精度最高,為16.00 °。冷浸漬3 d的小芒森葡萄酒中的總酸含量及還原糖含量均比冷浸漬1 d和5 d的總酸含量和還原糖含量要高?？梢钥闯?冷浸漬1 d的小芒森葡萄酒中揮發酸含量比冷浸漬3 d和冷浸漬5 d的要高。葡萄酒的基本指標沒有一定的變化規律,且對于葡萄酒來講,以上葡萄酒基本指標的微小變化對酒體沒有影響,因此說明冷浸漬時間對葡萄酒基本指標沒有明顯影響。

表1 不同冷浸漬時間條件下小芒森葡萄酒基本指標Table 1 Basic indicators of Xiaomiansen wine under different cold immersing time conditions

2.2 冷浸漬時間對果漿中微生物的影響

如表2,其中,Alpha多樣性(Alpha diversity)是對單個樣品中物種多樣性的分析[10],包括Sobs(observed species)指數、chao指數、ace指數,shannon指數以及simpson指數等,其中simpson指數最小,說明樣品中的物種越豐富。其中,Sobs指數、chao指數和ace指數反映樣品中群落的豐富度shannon(species richness),即簡單指群落中物種的數量,而不考慮群落中每個物種的豐度情況。

表2 樣品Alpha多樣性統計結果Table 2 Sample Alpha diversity statistics

根據表2中樣品Alpha多樣性統計結果分析,冷浸漬1、3、5 d過程中,隨著冷浸漬時間的增加,Sobs指數呈增加趨勢,chao指數及ace指數呈先減少后增加趨勢,shannon指數呈增加趨勢,simpson指數呈減小趨勢。因此綜合分析,shannon指數的增加、simpson指數的減小,說明真核微生物物種分類及豐度的變化趨勢為逐漸增加的趨勢,F1到F2增加不明顯,F3中真核微生物的物種數量最高。

2.3 冷浸漬時間對小芒森葡萄酒中的揮發性物質的影響

如表3可知,小芒森干白葡萄酒F1中共檢測出77種,其中包括21種醇類化合物,33種酯類化合物,11種酸類化合物,以及醛酮類、苯類等其他化合物共15種;F2中共檢測出78種揮發性物質,其中包括18種醇類化合物,36種酯類化合物,9種酸類化合物,以及15種醛酮類、苯類等其他化合物;F3中共檢測出86種揮發性物質,其中包括20種醇類化合物,41種酯類化合物,9種酸類化合物,以及醛酮類、苯類等其他化合物共16種。冷浸漬1、3、5 d處理中,葡萄酒中香氣物質總含量分別348.74、345.31、402.5 mg/L。F3中香氣物質總含量最高,其中醇類、酯類化合物含量是三個處理中最高,為酒體帶來濃郁花香果香。F1、F2、F3中含量最高的醇類、酯類、酸類、醛酮類化合物分別為異戊醇、苯乙醇、辛酸乙酯、葵酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸和二異丁基酮。

表3 不同冷浸漬時間條件下小芒森干白葡萄酒中揮發性物質組成及含量(mg/L)Table 3 The composition and the concentrations of the volatile compounds in Petit Manseng dry white wine under different cold maceration time conditions(mg/L)

續表

續表

異戊醇具有溶劑味、指甲油味、酒精味[11];苯乙醇具有玫瑰花香、蜜香;辛酸乙酯具有怡人的香蕉、梨的果香氣味;葵酸乙酯具有梨果香氣;己酸乙酯具有香蕉味及青蘋果香氣[12];乙酸異戊酯具有香蕉等果香;辛酸具有奶酪略粗澀的氣味[13];二異丁基酮具有果香及薄荷氣味[14]。因此以上物質給予酒體濃郁的花香果香蜜香,其次是略微的草本及脂肪香氣,使得酒體香氣更加豐滿有層次。

本實驗中三個處理香氣物質的變化趨勢是在第5 d達到最高,尤其是對酒體花香果香作出重要貢獻的醇類和酯類物質在第5 d處理中含量最高。葡萄酒中的香氣有不同的來源,高級醇、酯和酸等主要香氣物質[15-16]屬于發酵香氣,是發酵過程中微生物產生的。冷浸漬過程中存在著葡萄果實上自帶的大量真核微生物,它們生理活動也會對醇類、酯類揮發性化合物產生直接影響。真核微生物中不僅有各種真菌,還有多種野生酵母對葡萄酒的香氣都有著重要貢獻。有研究表明,自然發酵過程中,葡萄表皮附著的真核微生物中的一些非釀酒酵母屬及其他種屬的酵母均對葡萄酒香氣物質的多樣性和含量的形成具有積極作用[17-18]。

Alpha多樣性統計結果分析,樣品中真核微生物物種數量的變化趨勢為逐漸增加的趨勢,與F1相比,F2中真核微生物含量略高,F3中明顯高出很多,冷浸漬過程中微生物的豐度及多樣性對香氣物質的數量及總量產生影響。在低溫浸漬下F1、F2中真核微生物在前三天處于延滯期,又稱為調整期或適應期,因代謝系統適應新環境的需要,物種數量沒有明顯增加[20],又由于醇類物質揮發性較強,如圖1所示F1到F2過程中醇類揮發性物質含量有所下降。F2到F3中的醇類物質含量又有所增加,這一時期醇類化合物中含量變化較大的有異戊醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、苯乙醇,這可能是由于真核微生物處于快速生長期,較低的浸漬溫度刺激了野生酵母的繁殖合成高級醇所致[19]。酯類物質的合成受酶的調控,不同酵母菌株酯酶含量不同,則產酯的能力不同[19]。劉峻溪在其野生酵母和商品酵母發酵葡萄酒中揮發性成分差異研究中得出結論,野生酵母會產生更高的脂肪酸乙酯[20-21]。經計算得出,F1、F2、F3中脂肪酸乙酯的總含量分別為187.87、199.29、222.07 mg/L,其中己酸乙酯、2-己烯酸乙酯、5-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯(脂肪氣味)表現最明顯,在F1到F3中均呈逐漸增加的趨勢,F1到F2中呈微量增加,F2到F3中增加較明顯,樣品中真核微生物物種數量變化同樣呈增加趨勢。浸漬時間的延長使F3中脂肪酸乙酯含量增加,增強了的葡萄酒中的果香味。

圖1 小芒森F1、F2、F3處理中不同種類香氣物質的種類及含量Fig.1 The types and contents of different kinds of aroma compounds in the treatment of F1,F2 and F3

3 結論與討論

在F1、F2、F3過程中,真核微生物呈逐漸增加趨勢,香氣物質總含量總體呈增加趨勢,醇類物質由于其揮發性較強,其含量呈先減少后增加趨勢,酯類物質較穩定呈逐漸增加趨勢,尤其脂肪酸乙酯表現最為明顯,在物理及微生物的作用下F3香氣物質總含量最高,因此冷浸漬五天釀造的葡萄酒更加香氣濃郁、具有層次感。本實驗只對冷浸漬過程中真核微生物豐度變化及小芒森整體香氣物質的變化做出了初步探究,微生物是否對香氣物質產生影響以及具體是哪種微生物或是其中哪種酵母(包括釀酒酵母和非釀酒酵母)對何種香氣物質產生影響尚需要研究。