單基因病攜帶者篩查研究進展

莊彩霞，蔣宇林，劉俊濤

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院，北京 100730)

出生缺陷是影響人口素質的全球性問題，而單基因病是導致出生缺陷的一個重要原因。單基因病遵循孟德爾遺傳定律，隱性遺傳病的攜帶者無癥狀卻可生育患病后代。對于嚴重遺傳病的攜帶者篩查可顯著降低該嚴重疾病患兒的流行率。本文對單基因病攜帶者篩查的歷史和現狀以及未來研究方向進行了闡述。

一、單基因病與攜帶者篩查

單基因遺傳病是兒童畸形和殘疾的主要原因之一，種類繁多。據流行病學統計，全球范圍內單基因遺傳疾病影響1%活產兒，占嬰兒死亡率的10%以及兒科住院率的20%[1]。多數遺傳性疾病沒有有效的治療方法，具有終生性治療的特點。針對致病基因的生物技術(如轉基因、RNA干擾、基因組編輯)已經成功應用于一些遺傳性疾病治療[2]。但生物技術的安全性亟待確認，且其治療費用高造成沉重的精神和經濟負擔。攜帶有隱性致病基因突變的人，被稱為“攜帶者”。國外一研究結果顯示無表型人群中人均攜帶有2.8個致病突變(0～7個)[3]。美國的一項涵蓋上百種基因病檢測的研究[4]，研究結果表明受試者中24%至少有1種突變，5.2%受試者是多種疾病的攜帶者，5.4‰的夫妻攜帶同一致病突變。理想情況下，在孕前明確準父母的攜帶狀態，進行充分咨詢后，夫妻作出生育自主選擇。攜帶者夫妻可選擇輔助生育，如胚胎植入前遺傳學診斷，或產前診斷以避免嚴重遺傳病患兒出生[5]；或可以為患兒的出生進行充分準備，極早進行干預[6]。

二、攜帶者篩查的發展史

單基因病的篩查開始于1963年對新生兒進行的苯丙酮尿癥篩查。新生兒篩查的最主要目的是確定新生兒期潛在致死或致殘的疾病，或通過早期干預顯著改善患兒生活質量和預后。但分娩后的篩查檢測可能耽誤部分需要盡早干預的新生兒代謝性疾病的治療。自上世紀七八十年代，單基因遺傳病攜帶者篩查的開展使得對某些單基因病的干預時機前移。

最初的篩查工作開展是以種族為基礎進行的，20世紀70年代開展了Tay-Sachs病的攜帶者篩查[7]。攜帶者篩查的應用使Tay-Sachs病在德系猶太人群中的發病率減少超過90%[8]，明確表明了攜帶者篩查對降低出生缺陷的重要意義。2004年，美國婦產醫師協會(ACOG)發表聲明，推薦在德系猶太人后裔中進行包括Tay-Sachs病、Canavan病、囊性纖維化(CF)等四種特定疾病的攜帶者篩查[9]。20世紀90年代末和21世紀初，發表了關于CF的攜帶者篩查的建議。美國國立衛生研究院于1997年發表首次聲明，建議對有CF家族史的人以及妊娠期夫妻進行攜帶者篩查[10]。2001年美國醫學遺傳基因組學會(ACMG)和ACOG發表了指南(2013年重申)，建議對北歐和德系猶太人后裔進行CF的篩查[11]。

傳統攜帶者篩查側重于特定種族的特定高發疾??；而隨著基因技術的發展，檢測成本降低，涵蓋數種至百種疾病的攜帶者篩查panel得到了更廣泛的應用。2009年開始，攜帶者篩查從基于種族的單個疾病篩查發展到在商業化實驗室進行的無論種族的百種疾病同時篩查[12]，這種基于panel的多種疾病同時篩查的泛族裔篩查稱為擴展型攜帶者篩查(Expanded Carrier Screening，ECS)。2011年ACOG指南(2017年更新)，推薦攜帶者篩查應用于育齡期人群，不局限于種族背景[13]。在過去幾年，提供ECS的實驗室數量和包含在panel中疾病數量持續增加。Lazarin等[4]已報道，來自美國的一項關于攜帶者篩查的研究應用的panel可同時檢測400多種致病突變，其涵蓋了108種單基因遺傳病。隨著分子遺傳技術的發展進步，尤其是基于panel檢測和高通量測序的發展，ECS應用的疾病種類已達到五百余種[14]，檢測費用隨著技術發展而下降。在歐洲，ECS的應用推廣相對較慢，篩查的應用主要局限于疾病高發的特定種族人群和接受人工輔助生殖者[15-16]。而最近研究表明，歐洲普通人群對ECS的應用感興趣[17-18]，并且不久的將來許多歐洲國家對ECS的需求和接受度可能會增加。目前，在美國進行ECS檢測的人數每年達20萬[19]，ECS的應用越來越受歡迎。

三、 攜帶者篩查的現狀

傳統的攜帶者篩查是基于特定的單基因遺傳病家族史或基于種族背景下攜帶頻率較高的特定疾病的篩查。在歷史發展和社會變革中，基于社會結構的改變、社會人口流動、種族間通婚、收養及未知種族或種族背景復雜等變化，正確評估和確定個體的種族變得越來越困難。ACOG和ACMG推薦，以種族為基礎的單病種攜帶者篩查模式需向泛族裔的多種疾病聯合篩查(即擴展性攜帶者篩查，ECS)模式轉化。

國外權威學術機構相繼發布關于ECS的臨床應用指南規范。2015年，美國遺傳和生殖健康組織推薦ECS只應用于早發的嚴重影響健康的致殘、致死的疾病，不推薦應用于成年期發病或外顯率低、表達異質性高的疾病[20]。越來越多疾病的遺傳和表型關聯性認知度的增加使得更多的單基因遺傳病被納入到ECS的范疇內。二代測序(NGS)等分子技術的發展改變著臨床基因檢測的格局，ECS檢測越全面，假陰性率越低，但會導致檢測的假陽性率增加。由于某些變異基因臨床意義不明確，建議攜帶者篩查應限用于目前已知基因型-表型關聯明確的突變基因；在臨床應用中，ECS的芯片發展需要有明確的醫療標準，而不應包括技術能檢測的所有疾病[20-22]。2017年，ACOG行業指南推薦每一名孕婦都應被告知攜帶者篩查的實施[13，23]。攜帶者篩查模式同時需保持對于普通大眾群體篩查檢測的適用性，需要具有良好的成本-效益。隨著分子技術的進步降低了攜帶者篩查的成本，使得多種疾病聯合篩查費用不超過以往的一種特定單基因遺傳病的檢測費用。

國外關于攜帶者篩查的形勢已是大勢所趨，現有不少成果發表。2016年美國醫學會雜志(JAMA)刊登了基于三十萬余例樣本的多達94種臨床嚴重疾病的應用ECS進行相關研究[24]。同年，醫學遺傳學雜志(Genetics in Medicine，GIM)刊登了基于猶太人群的多種疾病聯合篩查的研究[25]。2017年，澳大利亞針對3種單基因遺傳病聯合篩查(CF、脆性X綜合征、脊髓性肌肉萎縮癥)，發現受影響妊娠數量比例與唐氏綜合癥相當[26]。理想情況下，孕前向準父母提供攜帶者篩查，可以最大限度地提高攜帶者夫妻的生殖自主權。但由于計劃外妊娠以及在孕前夫妻對攜帶者篩查認知的限制，妊娠期的夫妻也應該在產前被提供攜帶者篩查[6，22，27]。因此，為了識別無癥狀的生育期攜帶者，評估其生育風險，有效降低出生缺陷，攜帶者篩查的目標人群定位于妊娠或計劃妊娠的夫妻[13]。產前攜帶者篩查并不能替代新生兒篩查，但同樣不能因新生兒篩查而忽略產前篩查的價值及重要意義。攜帶者篩查受益的不僅僅是攜帶者本人，其親屬可能攜帶有同一致病基因，鼓勵其告知親屬攜帶風險和攜帶者篩查檢測的可用性，以指導生育決策，必要時進行遺傳咨詢，選擇相應的輔助生育措施。ECS作為出生缺陷防控的有效手段已成為ACOG和ACMG等專業學會的共識。

目前，我國國內臨床針對遺傳性疾病篩查的咨詢能力普遍不足，大眾人群對攜帶者篩查認知度低，孕前人群優生優育觀念不足，基于以上原因，國內尚無ECS的臨床應用開展。

四、擴展性攜帶者篩查檢測方法

目前在產前診斷領域應用到的遺傳檢測方法有多種。產前診斷最常見的核型(染色體分析)及結合熒光原位雜交(FISH)。隨著分子技術的發展，PCR分子檢測技術用于基因檢測，例如Sanger測序[28]；測序技術的迅猛發展，NGS利用大規模平行測序，提高了基因檢測的效率，降低了成本，對包括攜帶者篩查在內的分子檢測產生重大影響[29]。目前應用的基因檢測方法包括染色體微陣列分析(CMA)、NGS及靶向基因組測序和全外顯子測序。CMA中的熒光標記DNA與載有數千個基因探針的panel雜交，可識別具有DNA拷貝數重復或缺失的區域。CMA目前是針對患有多種先天異常、遺傳綜合征以及智力和發育障礙的兒童或成人[30]。CMA引入產前診斷，作為胎兒超聲異常的首選基因診斷檢測[31]。對發現單基因病的新的致病突變或罕見變異或可應用全外顯子測序及全基因組測序等分子檢測技術。但全外顯子測序應用可能導致檢測出許多意義不明的變異(VUS)，對于無先證者的情況下應用于產前診斷，將為受檢者帶來不必要的焦慮。全外顯子測序和全基因組測序等技術的應用可能同時帶來諸多倫理挑戰，分子技術的應用與倫理并行，更需謹慎評估與應用。

五、攜帶者篩查panel中納入疾病種類以及變異位點的選擇

隨著分子檢測技術的發展，ECS的檢測panel包含疾病的數量持續增加[6]。商業實驗室技術的發展之快速，可見一斑。但臨床的應用上卻無法跟上實驗室技術進展，臨床應用對檢測的疾病種類需要有明確的醫療指征和標準[32]。對納入疾病種類的選擇上，需要考慮疾病的嚴重程度、發病年齡、患病率、攜帶率、成本效益以及受影響個體的治療或其他干預方案的可用性(包括植入前或產前診斷等)。

ACOG委員會對ECS篩查疾病種類的納入問題提出建議，包括檢測病種的攜帶率>1/100、基因型-臨床表型的明確聯系以及需要臨床干預[33]。ECS的目標疾病應該是嚴重致殘致畸出生缺陷的疾病、早期發病或具有干預措施的遺傳疾病[13]。但疾病癥狀輕、成人期發病、自然病史未知或攜帶率非常低的疾病，不推薦進行ECS[13]。攜帶者篩查病種可包括[22]：(1)常染色體隱性遺傳(AR)疾病的攜帶者的兄弟姐妹有2/3風險攜帶同樣的隱性致病基因。若夫妻攜帶同一致病基因，其后代有1/4患病的風險，選擇造成嚴重致畸致殘的出生缺陷的疾病。(2)國外指南提到可納入極少數常染色體顯性遺傳(AD)疾病，可通過ECS識別AD疾病，且國外部分商業實驗室的檢測芯片中對AD疾病也有納入。但疾病的外顯率和表達異質性可能影響疾病的癥狀以及嚴重程度，現階段并不一定適合納入ECS檢測范圍內。(3)部分ECS也包括X連鎖疾病，例如脆性X綜合征和Duchenne型肌營養不良癥(DMD)。由于X失活現象的存在，女性攜帶者可能有也可能無該疾病癥狀，或具有輕微癥狀。同時，女性攜帶者有50%可能生育男性患兒的風險，而子代中女性50%可能為攜帶者。在2017年對美國商業ECS篩查panel中包含的疾病進行的審查中，其列入篩查panel的疾病僅有27%總體上符合醫療納入的標準[34]。

對于ECS檢測目標疾病涉及到的致病突變的選擇，2013年ACMG發布聲明中推薦對與疾病嚴重性有明確臨床相關性的變異位點進行檢測[21]。同時，2015年ACMG、ACOG、美國圍產兒保護基金會(PQF)、美國遺傳咨詢協會(NSGC)和美國母胎醫學協會(SMFM)發布關于ECS在生殖醫學中的聯合聲明，明確建議1)對檢測的基因和變異應與表型關系明確；2)測序檢出的臨床意義未明變異不應報告；3)實驗室檢測應報告所有致病變異和疑似致病變異；4)對于等位基因頻率較高、外顯率低的變異不推薦進行篩查[20]。ECS檢測panel中納入疾病和變異位點，在大眾人群中的發病率必須明確，在檢測平臺上的突變檢出率必須明確，以便于評估在檢測結果陰性者的殘余風險[21]。對檢測變異位點的選擇與限制可能降低需要隨訪的人群數量，若檢出VUS可能引起受檢者不必要的焦慮，對進行遺傳咨詢的醫師要求非常高。

六、攜帶者篩查臨床開展將面臨的困難

據NSGC、ACOG和加拿大和歐洲的遺傳學會的建議，應對攜帶者篩查檢測者進行檢測前、后的咨詢[20，22，35]。尤其是充分遺傳咨詢對于計劃外妊娠夫妻或因攜帶者篩查認知限制的妊娠夫妻進行攜帶者篩查檢測。但由于文化程度等的影響，臨床上進行充分的遺傳咨詢有一定困難。若夫妻攜帶同一隱性致病基因者在充分遺傳咨詢前提下，若產前診斷還面臨的流產等風險問題。另外，夫妻雙方或一方為攜帶者時，可能影響家庭的穩定，造成醫患關系緊張以及隨訪困難，這些隱形的倫理問題困難重重。攜帶者篩查檢測并非由專業醫療機構提供，而更多的由商業實驗室提供。商業實驗室直接面向消費者，對于ECS項目的監管和責任制度迫切需要制定行業準則與標準，且商業實驗室能否提供完整充分的遺傳咨詢令人擔憂。

檢測后醫生需評估殘余風險，即檢測陰性并不能完全排除生育患兒風險的可能性[23]。原因包括：ECS檢測疾病的位點通常是最常見和已知明確致病突變，檢測并不涵蓋該疾病的所有致病變異。如果攜帶頻率和檢出率已知的情況下，檢測后殘余風險可被計算出[21，36]。但某些疾病的攜帶頻率和檢出率并不能明確，造成殘余風險評估不能準確量化，導致遺傳咨詢更大的困難。

七、攜帶者篩查的局限性

現行的各ECS的檢測存在很大差異，其panel中最顯著的差異之一是篩選出的基因數量(40～1 500個)，僅有三個基因是16個檢測panel都包含的[32]。臨床關于ECS的臨床數據支持還有很大欠缺，需要進一步評估其臨床應用。由于檢測范圍的局限性及基因突變的多樣性，不能排除所檢測基因或特定突變之外存在其他變異位點的攜帶，ECS陰性檢測結果存在一定的殘余風險。由于檢測技術的原因，可能會有其他致病基因攜帶狀態的意外結果檢出，需要進行必要的遺傳咨詢。檢測過程中可能會發現非婚生或夫妻屬于近親緣關系。隱性遺傳疾病攜帶狀態的披露，可能為受試者及家庭帶來心理壓力及生育壓力，及其他妊娠期不必要的壓力或焦慮[37]。同時，孕前和產前獲得逐漸增多的遺傳信息量也帶來了需要慎重面對處理的道德和遺傳咨詢的挑戰[38]。

八、攜帶者篩查的發展方向

未來發展中，WES及全基因組測序(WGS)可能發展為ECS的檢測技術。隨著醫生對實驗室檢測的基本認識的加強，對患者提供宣教和遺傳咨詢非常重要。商業化實驗室直接面向消費者的營銷及大眾媒體在促進ECS方面的影響等挑戰備受關注，個人、社會、法律和倫理方面的影響值得進一步評估。

現今國內對于攜帶者篩查的認識不足，適合中國人群的篩查模式尚不明確，也沒有相關的指南或共識指導臨床應用。為構建完整的符合國情的出生缺陷防治體系，必須啟動中國人群攜帶者篩查的研究，提出適用于中國人群的篩查模式。評估攜帶者篩查檢測開展過程中需關注的臨床咨詢、檢測及質控等問題，推進國內對攜帶者篩查檢測工作的進一步認知，對提升出生入口質量、降低出生缺陷有重要意義。