基于核磁共振的代謝組學技術在肉品科學中的應用

秦澤宇,王 浩,溫榮欣,孔保華

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波譜分析具有高通量、重復性高、樣品處理簡單和分析時間短等優點,特別適用于分析食品這種復雜體系[1]。NMR按照磁體強度可分為高場核磁共振(高分辨率)和低場核磁共振(低分辨率)。低分辨率NMR波譜技術在國內食品科學領域的研究已經相對成熟,本文不再贅述,而高分辨率NMR由于需要配備昂貴復雜的儀器,因此高分辨率NMR波譜分析技術在國內食品科學尤其肉品科學領域中的應用并不多見[2]。代謝組學是一門交叉學科,其將分析化學、有機化學、基因組學、表達組學、化學計量學和信息學等學科相互結合,分析組群指標而非單一指標,借助高通量檢測和多元數據處理,具有整體觀的思路,是對所有低分子量代謝物(<1500 Da)進行定性和定量分析的一種技術[3-4]。而基于NMR的代謝組學技術主要應用于生物、醫藥尤其是中藥的研究[5]。在食品科學與工程領域,有學者成功將該技術應用于食品鑒別、食品質量控制、食品加工和貯存、預測和鑒別食品味道等方面,Fotakis[6]等利用NMR代謝組學技術鑒別了不同葡萄酒所用葡萄產地的不同,Ko[7]等利用此技術分析了醬油在不同陳化年份的代謝特征,Ye[8]等研究了加工對條斑紫菜產品的營養物質組成的影響,Wei[9]等對多種咖啡豆的味道進行了預測;在肉品科學領域,也有學者進行了相關報道[10-12]。但是整體而言,基于NMR的代謝組學技術在肉品科學的應用較少。

因為基于NMR的代謝組學技術具有諸多優點,在食品領域前景寬廣。本文將從NMR以及代謝組學的基本原理、基于NMR的代謝組學技術的數據處理方法及其在肉品科學中的應用進行綜述,并展望了此技術在研究動物福利對肉品質的影響和小分子代謝物對肉品質影響中的應用。

1 NMR基本原理簡介及NMR波譜解析

NMR研究的對象是具有磁矩的一類特殊原子核,具有磁矩的原子核有自旋性質,具有一定的自旋量子數(I),,N=0,1,2…(取整數),I=1/2的原子核在自旋過程中核外電子云呈均勻的球形分布,核磁共振譜線較窄,因此自旋量子數是1/2的核,如1H、13C和31P是NMR的主要測試對象。無外加磁場時,核的自旋是無規則的。若將原子核置于外加磁場中,則核可以形成規則的自旋取向。外加磁場中,自旋量子數為I的核,共有2I+1個自旋取向,每個自旋取向用磁量子數m表示,m=I,I-1,I-2,0,…,-1。以1H為例,磁量子數有兩個值,m=1/2,m=-1/2,也就是說1H在外加磁場B0中,核有兩個自旋取向,m=1/2,自旋取向與外加磁場一致,能量較低;m=-1/2時,自旋取向與外加磁場方向相反,能量較高。在外加磁場中核發生的能級分裂是核磁共振的基礎。當用特定頻率的電磁波照射磁場中的1H核時,核的自旋取向就會由低能態躍遷到高能態[13-14]。

在肉品科學主要應用三種NMR波譜,根據不同的元素可以分為核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)、核磁共振碳譜(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)和核磁共振磷譜(31P nuclear magnetic resonance,31P NMR),這三種波譜分別可以檢測含H化合物,含C化合物和含P化合物的組成和結構。下面以1H NMR為例簡單解析NMR波譜,1H NMR波譜主要提供下列信息:通過峰的數目得到標志分子中磁不等價質子的種類;通過峰的強度(面積)可以得到每類質子的數目(相對);通過峰的位移(δ)的得到每類質子所處的化學環境;通過峰的裂分數得到相鄰碳原子的質子數;通過耦合常數(J)確定化合物的構型[13-14]。

2 基于NMR的代謝組學技術數據處理方法

基于NMR的代謝組學技術所得的數據具有高維,小樣本,高噪聲等復雜特征,因此采用常規統計方法不能發現樣品之間和各組之間的異同,通常采用以下兩類分析方法:非監督分析方法,主成分分析法(principal component analysis,PCA)和聚類分析法(hierarchical cluster analysis,HCA);有監督分析方法,偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)、正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projection to latent structures discrimination analysis,OPLS-DA)。一般而言,數據處理順序都是先利用非監督分析法直觀的說明不同樣品之間的差異;其次利用有監督的分析方法擴大組間差異,但是需要通過排列實驗來證明模型的有效性[15]。除此之外,機器學習算法諸如隨機森林(random forests,RF)和支持向量機(support vector machine,SVM)也被應用到代謝組學的數據處理方法中[16]。

3 NMR代謝組學技術在肉品科學中的應用

NMR代謝組學技術具有整體觀的思路,不再局限于分析某一個或者某幾個化合物,在數據處理時需要運用多元統計分析,不僅從整體上區分不同樣品,還能識別區分差異的特殊標志物。NMR代謝組學已經被應用于確定原料肉產地的問題、區分不同品種的原料肉、不同年齡肉畜的原料肉、不同飼料喂養對肉品質的影響、不同成熟時間的原料肉、不同輻照強度處理過的原料肉、不同儲存時間和溫度對肉品質的影響和解決肉制品摻假問題。

3.1 NMR代謝組學研究宰前因素對肉品質的影響

影響肉品質的宰前因素主要包括:遺傳因素,物種、品種、性別和年齡;營養因素,飼料的能量、組成和喂養方式;宰前應激因素,宰前休息、宰前禁食和宰前淋浴;原料肉的解剖學位置[17-19]。NMR代謝組學已被部分學者采用研究宰前因素對肉品質的影響。

原料肉產地不同導致肉制品和原料肉的NMR代謝組學數據不同,進而通過此技術確定原料肉產地。Shintu[20]等利用MAS-NMR區分了來自于澳大利亞、巴西、加拿大、瑞士和美國的牛肉干。通過PCA分析數據確定了不同國家的牛肉干的差異性,并且確定了部分代謝物如肌肽、酪氨酸、肉毒堿和苯丙氨酸可以作為標志物區分不同國家的牛肉干,經有監督的多元統計分析模型驗證,此研究中80%的樣品可以被準確地確定產地。Jung[21]等也利用NMR代謝組學區分了來源于四個不同國家的牛肉(澳大利亞、新西蘭、韓國、美國),盡管樣品數量有限,但是仍然顯示出NMR代謝組學在此方面的潛力。

肉畜的品種、肌肉的解剖學位置和雜交種的親本影響肉的品質。Ritota[22]等利用NMR對契安尼娜牛、瑪萊瑪娜牛、荷斯坦牛、美洲野牛四種牛的背最長肌、半腱肌提取物進行代謝組學分析。通過PCA和PLS-DA多元統計分析,可以辨別出每種牛的背最長肌和半腱肌的不同,并且確定了用于區分的代謝標志物。對于契安尼娜牛,代謝標志物包括甘氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、肌肽、肉毒堿、?；撬?、乳酸、核苷酸、葡萄糖和脂肪酸;對于美洲野牛,代謝標志物包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸和脂肪酸;對于瑪萊瑪娜牛,代謝標志物包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸、醋酸鹽、丙酮酸鹽、羥丁酸鹽生物、肉毒堿、?；撬?、核苷酸、肌肽和脂肪酸。NMR代謝組學技術不能區分荷斯坦牛的背最長肌和半腱肌。在更深入的研究中,將肌肉按照功能或者感官特性分類,NMR代謝組學可以提供區分不同功能或者不同感官特性的肌肉的可靠信息。Straadt[23]等利用NMR代謝組學技術研究了五種雜交豬。五種雜交豬種分別為DLY(由杜洛克豬、約克豬和長白豬雜交)、ID(伊比利亞黑豬和杜洛克豬雜交)、ILY(伊比利亞黑豬、杜洛克豬和長白豬雜交)、MD(曼格里察豬和杜洛克豬雜交)、MLY(曼格里察豬、長白豬和約克豬雜交)。經代謝組學分析,DLY肉樣中肌肽和肌苷酸含量低于其余四種,但是肌苷的水平高于其余四種;不同雜交種的肉中氨基酸含量、種類不同。由于肉的理化成分以及性質決定著肉的感官特性,進而影響肉品質,因此在此研究中Straadt[23]等嘗試將NMR代謝組學提供的代謝物信息與感官特性相聯系來挖掘NMR代謝組學技術在此方向的潛力,但是NMR代謝組學提供的信息與肉的部分感官特性如滋味和風味沒有明顯的相關性。這可能是由于不同雜交豬的肉品質在風味和滋味方面沒有明顯的不同。但是在其他方面,如肉的嫩度和肌肽與代謝物信息有一定的相關性。

動物的年齡同樣也可以對肉品質造成影響。Liu[24]等研究了鴨的年齡對于肉品質的影響,鴨分別在孵化后27、50、170、500 d進行屠宰,NMR代謝組學分析結果顯示甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、延胡索酸、鵝肌肽、甜菜堿、?；撬岷图≤盏暮颗c動物的年齡相關。雖然隨著年齡的增長,鴨肉中的風味化合物呈現上升趨勢,但是鴨肉的持水力,嫩度卻呈現下降趨勢,綜合考慮,作者得出了屠宰年齡50 d的鴨肉質的可接受度最高,這一結論也與之前的研究者得出的結論類似[25]。

一些生物活性物質例如芝麻素具有抗氧化的能力,當添加至動物的飼料中時,可以調節動物的脂質代謝,從而影響肉品質[26]。Wagner[27]等用NMR代謝組學技術研究了在大西洋三文魚飼料中添加芝麻素對肉品質的影響,通過PCA和OPLS-DA分析表明隨著芝麻素添加量增多,對n-6脂肪酸與n-3脂肪酸比例影響越大,代謝物如葡萄糖、糖原、亮氨酸、纈氨酸、肌氨酸、肉毒堿、乳酸和核苷增加,這些代謝物與能量代謝相關,表明芝麻素影響三文魚的能量代謝。

3.2 NMR代謝組學研究宰后因素對肉品質的影響

影響肉品質的宰后因素主要有肉的存儲溫度,僵直后的成熟時間,以及人工處理因素例如電刺激等等,此前已經很多研究從宏觀的角度研究了宰后因素對肉品質的影響[28-30],近年來,NMR代謝組學被應用于此研究方向。

肉的成熟影響著肉的嫩度和風味,這主要因為動物屠宰后,組織蛋白酶和肌漿鈣離子激活因子在熟化過程中降解了一些關鍵性蛋白質,破壞了原有肌肉結構,同時組織蛋白酶的水解產物改善了肉的風味[31]。為了對這些生化反應過程有更加詳細的認識,研究人員應用了NMR代謝組學技術。Graham[32]等研究了成熟時間為3、7、14和21 d的牛肉的區別,經NMR代謝組學分析,不同成熟時間的牛肉氨基酸含量的不同,且隨著成熟時間的增長,氨基酸含量增多,這是由于隨著肉的成熟,蛋白水解所致。

Shumilina[33]等通過NMR代謝組學技術監測在0 ℃和4 ℃存貯的三文魚代謝組所發生的變化,結果顯示共有31種代謝物影響魚的新鮮度和滋味,包括氨基酸、二肽、維生素、糖類、生物胺、以及ATP的降解產物,確定了計算魚的新鮮度(K值)所必須的代謝物;發現生物胺與K值的關聯性最強。Shumilina[11]等還通過NMR代謝組學探究了三文魚副產品在存儲期間的質量變化,得到了相同的結論。

3.3 NMR代謝組學在肉制品加工和肉制品安全問題中的應用

在肉制品加工工程中,不同的加工處理方式,對肉品質產生不同的影響,為了從分子層面識別不同的加工處理方式對肉品質的影響,近年來,NMR代謝組學技術開始被應用。輻照技術是一種殺菌處理方式,Zanardi[10,34]等利用NMR代謝組學技術分析被輻照處理的牛肉,確定了含有脂肪的輻照食品標志物2-十二烷基環己酮,但是在肉制品吸收輻射能量小于8kGy時,1H NMR檢測不出2-十二烷基環己酮。高壓處理是一種常見的增強肉制品品質的方式,Yang[35]等研究了高壓處理對于鹵肉產品質量的影響,通過NMR得到26種代謝物的信息,主要包括氨基酸類、糖類、有機酸類、核苷類以及它們的衍生物,通過PCA分析得出不同壓力處理對代謝組的影響,最終得出150 MPa是最經濟的改善產品質量的方式。肉制品尤其是發酵類的風干腸,成熟時間決定著最終產品的組分以及質量。Grossi[36]等利用NMR代謝組學技術分析不同成熟時間的帕爾瑪火腿中的游離氨基酸組分的變化,并進行了定量。Garcia-Garcia[12]等通過西班牙風干腸在0、2、4、7、11 d NMR代謝組數據,識別了發酵期和風干-成熟期在代謝組成分方面的不同,動態監測了蛋白質、脂質和ATP的水解。

動物食品摻假問題一直是人們關注的食品安全問題,已經有多種較為成熟的肉類摻假鑒別技術,例如免疫分析法、色譜分析法和熒光定量PCR法[37]。NMR代謝組學技術快速無損的特點獲得研究人員的關注,并被成功的應用于此類研究中[2]。Jakes[38]等利用NMR代謝技術以兩種肉的氯仿提取物為樣本區分了牛肉和馬肉;無論是屠宰后的生鮮肉還是經過凍融的肉,均可以區分,這一結果表明冷凍處理不會對分析產生影響。區分兩種肉的標志物為不飽和脂肪酸,馬肉中的不飽和脂肪酸明顯比牛肉中高,尤其是亞麻酸。此研究體現了NMR代謝組學技術應用在肉制品摻假問題中的潛力。雖然在此實驗中,研究者利用的是60 MHz的低場譜儀,但是其研究思路與NMR代謝組學一致[38]。

4 結論與展望

研究已經證明NMR代謝組學在肉品科學領域具有很大實用性以及應用潛力,其可以最大限度的保證樣品不被損害,并可以實現連續的、動態的監測,因而得到更詳細的信息。1H NMR、13C NMR和31P NMR可以提供對肉品質的影響最大的代謝物的信息,例如乳酸、糖原、還有含磷的能量化合物,因而被成功的應用于分析這幾種代謝物影響肉品質的機理。動物的宰前管理,屠宰方式影響動物的應激反應,進而影響動物的代謝,因此,NMR代謝組學技術可以在以后應用于動物福利問題當中,這正逐漸成為人們關注的熱點。

NMR代謝組學技術雖然在肉品科學研究中應用較少,但是其具有整體分析的效果,而且在識別小分子生物標志物方面具有很大的潛力,正逐漸成為肉品科學中的一門新的分析方法,目前雖然通過該技術識別了一些標志物,但是這些標志物只是應用在區分產地、品種、加工方式和貯存方式等,雖然有學者嘗試建立起標志物與肉的食用品質的相關性,效果并不理想,因而需要更進一步的探討代謝物影響肉品質的機理。想要實現這一目標,則需要突破目前NMR技術和代謝組學技術的限制,因為目前經NMR識別的代謝物仍然是有限的,很多小分子代謝物并不能被識別,因此繼續發展超高分辨率的NMR技術是必需的。有的學者提出了NMR技術和質譜技術聯用,用質譜技術彌補NMR技術對于低豐度代謝物檢測能力不足的問題,同時,也有必要建立功能完整的代謝物數據庫。