RIP1在肝癌組織中的表達意義及其對細胞侵襲、遷移的影響

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肝癌是當前常見的肝臟惡性腫瘤，主要分為原發性和繼發性兩類，惡性程度極高，發現較晚，對患者生命健康造成嚴重威脅[1]。目前針對肝癌治療的方法主要包括手術治療、化學藥物治療、放射治療以及生物治療等，但由于該病易出現復發和遠處轉移，肝癌患者的預后仍不理想[2]。受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)是RIP家族最新成員，是一組具有同源激酶結構域但功能域不同的相似蛋白亞型[3]。研究發現，RIP1蛋白質，參與細胞凋亡，控制炎癥反應，影響細胞周期及維持組織或生物體的穩態[4]。Lin[5]指出，RIP1與非小細胞性肺癌的形成以及癌細胞侵襲過程有關。同時也有研究指出抑制RIP1的表達能夠促進大腸癌細胞的凋亡[6]。以上研究結果均在一定程度上提示RIP1具有促癌基因的效應，但RIP1與肝癌的關系尚不明確。因此，本研究結合組織病理染色及基因抑制實驗進行相關研究，通過體外抑制該基因的表達，并觀測RIP1基因被抑制后對肝癌細胞侵襲、遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 免疫組織化學染色與分析

收集48例肝癌組織及其對應癌旁組織并制作成石蠟切片，組織均來自于病理科，相關研究符合倫理學標準。取材及病理:肝癌標本按照腫瘤的實際侵犯位置取材，每個瘤塊取三個不同方位，在距離腫瘤取材周圍2 cm處留取癌旁組織，然后將肝癌及癌旁取材標本放入4%多聚甲醛溶液中固定,石蠟包埋,制成蠟塊。免疫組化方法:石蠟切片脫蠟和水化,修復抗原,滴加封閉液。加滴RIP1一抗液，4 ℃過夜。再滴加二抗，DAB顯色,蘇木素復染，中性樹膠封固。每次實驗均做陽性與陰性對照,陽性細胞槳著色為棕黃色，每例均設有HE切片作對照觀察。免疫組化結果判斷標準：采用雙盲法觀察切片，RIP1免疫組化在細胞膜上染黃色或褐色。實驗樣本根據細胞染色強度和細胞染色比例獨立評分。根據被染色細胞在細胞總數中所占的比例進行評分，陽性細胞<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，76%～100%記4分。該細胞染色的強度由顏色程度來確定，即無、弱、中、強評分分別為0、1、2和3分。每個病人綜合得分為0～7分，將RIP1low組的分數定為≤3分，RIP1high組得分>3分[5]。

1.2 儀器

人肝癌細胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7購于中科院昆明細胞庫；PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3購于中國科學院上海細胞庫；Trizol試劑和慢病毒轉染試劑polybrene購于上海翊圣生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；目的基因shRNA-1序列:5′-CACCGGAGGTGAATGAGGACTATAACGAATTATAGTCCTC ATTCACCTCCTTTTT-3′，shRNA-2序列:5′-CACCGTATATCAAACTGACAGAATCCGAAGATTCTGTCAG TTTGATATACTTTTT-3′。RIP1兔抗單克隆抗體，購自美國Abcam公司;ECL成像系統，由Bio-Rad Laboratories科技公司提供；Transwell小室購自于美國Corning公司。

1.3 肝癌細胞培養、篩選及沉默

Hep3B，SMMC-7721細胞使用RPMI-1640培養基10% FBS培養，HCCLM3、HepG2細胞用DMEM高糖培養基，10% FBS培養，以上細胞均置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待以上各細胞處于融合達70%～80%時，收取細胞蛋白，使用WB法，篩選出高表達RIP1的細胞株。將該細胞株使用上述方法，行慢病毒轉染。將所培養的細胞隨機分為三組：對照組、shRNA-1抑制組、shRNA-2抑制組。待各組細胞融合率達70%～80%時，經行轉染操作。其中，shRNA-1組、shRNA-2組分別轉染對應的RIP1慢病毒抑制基因序列，對照組加轉染試劑但不予干擾序列。使用并收集轉染72 h時的各肝癌細胞經行后續實驗。本研究RNA干擾設計圖見圖1。

圖1 RNA干擾設計圖

1.4 慢病毒載體沉默RIP1表達

采用WB法及RT-PCR法檢測。取各組轉染72 h細胞，提取蛋白，并進行定量測定。按照每孔約30 μg，按110 V恒壓電泳，220 mA恒流條件轉膜，轉膜時間約100 min。然后脫脂牛奶封閉1 h備用，再孵育RIP1抗體及內參，4 ℃條件下孵育過夜，第二日滴加二抗，室溫孵育1 h，曝光條帶并分析結果。經過實驗，挑選出HCCLM3肝癌細胞進行下一步實驗，RT-PCR法結果也驗證了該結論。

1.5 細胞侵襲及遷移能力測定

采用Transwell細胞侵襲試驗和細胞劃痕試驗測定細胞相關運動能力。細胞侵襲試驗，Transwell小室放置于預先制備好Matrigel基質膠的24孔板中，按上述條件在培養箱中過夜，向Transwell小室下室中加入500 μL含10% FBS的DMEM高糖培養基。用無血清的DMEM高糖培養液重懸各組細胞，取100 μL細胞懸液(細胞總數約1×105個)加至Transwell的上室。48 h后將小室置于4%的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內室膜上的細胞，結晶紫溶液(0.1%)染色10 min后顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5個視野拍照，統計并分析。細胞劃痕試驗，在6孔板中培養前述肝癌細胞，將細胞在無血清中持續饑餓24 h后使用移液槍頭進行劃傷，再用PBS洗滌，在0，24和48 h時使用相差顯微鏡進行拍照。隨后通過手動計數進行細胞抑制率的測定，相關結果用百分比表示，上述所有實驗均常規進行三次。

1.6 統計方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析處理。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化染色及病理分析

48例肝癌患者中，22例被染色，染色陽性率為45.83%，其中，強陽性患者為15例，中等及弱陽性7例，同時，有6例復發患者。觀察免疫組化染色結果，可見RIP1主要在細胞核中表達，RIP1在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織且在復發患者中的表達顯著高于未復發患者(均P<0.05)(圖2、圖3)。RIP1的陽性表達與患者的總生存率密切相關(OR=0.560，95%CI:0.383～0.818，P=0.003)且與無復發生存率(OR=0.540，95%CI:0.369～0.791，P=0.002)密切相關。

圖2 肝癌患者中的RIP1表達情況

圖3 復發和未復發肝癌組織中RIP1蛋白表達情況定量圖

圖4 不同肝癌細胞系中的RIP1表達情況

2.2 肝癌細胞系RIP1表達篩選

對各肝癌細胞系RIP1蛋白表達進行檢測，可見4個細胞株中，HCCLM3的RIP1蛋白相對表達量最高，可以用于后續實驗(圖4)。

2.3 肝癌細胞HCCLM3的RIP1抑制

觀察慢病毒載體抑制HCCLM3的RIP1的表達情況，可見shRNA-1組、shRNA-2組RIP1表達明顯被抑制，且shRNA-2組抑制效果更為明顯(均P<0.05，圖5)。

圖5 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制

2.4 肝癌細胞HCCLM3的RIP1抑制后侵襲能力改變

與對照組相比較，shRNA-2組可明顯抑制HCCLM3的細胞侵襲能力(P<0.01，圖6)。

圖6 肝癌細胞HCCLM3慢病毒載體抑制后的各組

2.5 肝癌細胞HCCLM3的RIP1抑制后遷移能力改變

與對照組相比較，shRNA-2組可明顯抑制HCCLM3的細胞遷移能力(P<0.05，圖7)。

圖7 慢病毒載體抑制肝癌細胞HCCLM3中RIP1

3 討 論

在以往的研究中，多數學者認為RIP1有助于腫瘤的抑制，因為該基因可以參與各種細胞應激，從而誘導細胞凋亡和程序性壞死[7]。如Qiu等[8]發現RIP1參與卵巢癌細胞CD40配體所驅動的壞死細胞樣細胞凋亡。在關于骨肉瘤的研究中，Fu等[9]也指出，紫草素正是通過激活RIP1和RIP3來發揮對骨肉瘤細胞的抑制作用。然而近期的研究卻發現，RIP1在腫瘤發病機制中可能有不同的生物學功能。部分學者在檢查了胃癌和正常胃組織中RIP1的表達情況后發現，與正常胃組織相比，RIP1在胃癌組織中表達顯著增強并且其表達程度與胃癌患者預后密切相關[10]。同時研究也發現，RIP1在黑色素瘤中也呈高表達，并通過調節NF-κB信號通路進而加速黑色素瘤細胞的生長[11]?；谝陨涎芯?，本研究設計了RIP1與肝癌細胞的實驗，并探討其表達程度與肝癌之間的關系。

首先本研究通過免疫組化實驗證實，48例肝癌患者22例均表現為RIP1陽性表達，陽性染色率為45.83%。同時，RIP1陽性表達程度與患者術后生存率以及無復發生存率密切相關，RIP1表達越高，患者術后生存時間越短且復發可能性越大。這也進一步證實了RIP1可能與肝癌患者的發病和預后存在關聯。之后本研究通過篩選出RIP1表達量最高的肝癌細胞系，HCCLM3中RIP1表達量最高并被應用于后續實驗。另外為了實驗的穩定性特選擇了兩條RNA抑制序列且shRNA-2抑制效果更明顯。腫瘤的侵襲和遷移指的是腫瘤細胞脫離原發部位向其他部位發生遠處轉移，并形成繼發性的新的腫瘤過程[12]。侵襲和遷移是目前惡性腫瘤最主要的特征也是引起患者死亡的重要原因[13]。隨著分子生物學以及基因靶向治療研究的不斷發展，越來越多的基因和細胞分子被證實在癌細胞的侵襲和轉移中起著不同的調控作用[14]。有研究證實抑制RIP1的表達能夠抑制皮膚黑色素瘤細胞的增殖[15]。Pietkiewicz等[16]在關于胰腺癌的研究中發現，沉默RIP1的表達可促進胰腺癌細胞的凋亡，對于胰腺癌具有保護作用。為探究RIP1與肝癌細胞生物學特性的影響，本研究設計了Transwell細胞侵襲試驗和細胞劃痕試驗，結果證實，抑制肝癌細胞中RIP1的表達后，肝癌細胞的侵襲和遷移也被顯著抑制。這也進一步證實了RIP1抑制對于肝癌細胞侵襲和遷移的保護作用。然而對于RIP1抑制肝癌細胞侵襲和遷移的具體機制尚未完全明確，今后仍然需要進一步從分子作用以及信號通路等層面進行后續研究。

綜上所述，RIP1在肝癌中存在高表達，可能參與了肝癌細胞的侵襲和遷移過程。慢病毒載體抑制HCCLM3肝癌細胞中RIP1的表達可抑制肝癌細胞侵襲及遷移能力，RIP1可能會發展并成為HCC患者預后不良的新型生物標志物以及今后肝癌治療的潛在靶點。