生殖細胞基因編輯與基因治療的問題與展望
——以CCR5基因為例

， ， ， ， ， ,*,

(1.蘇州大學附屬第二醫院，江蘇 蘇州 215004；2.人和未來生物科技有限公司，湖南 長沙 410000；3.湖南郴州第一人民醫院南華大學醫學轉化研究所，湖南 郴州 423000；4.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000)

醫學科學研究和醫學臨床實踐，需要遵守人類的國際準則和國家的具體法規[1-3]。最近報道的基因編輯嬰兒，是一起破壞人類醫學倫理底線的非法行醫事件的結果。本文僅擬對基因編輯嬰兒的基因型與HIV感染關系進行分析，并探討目前基于基因編輯或基因治療受精卵的技術局限性和未來需要發展的技術路徑。

1 體細胞基因治療與生殖細胞基因治療的目前界線

基因編輯技術已廣泛用于除人之外的多物種的基因組的改造，為人類的生活帶來了革命性的影響，促進人類更健康更長壽的生活[4-5]。然而，由于脫靶效率太高和靶效率也無法保證等多方面的技術不足，基因編輯技術直接應用到改造人類自身屬于既沒有安全保障也沒有倫理法規的許可。學術界和人類社會的共識是，通過多種法律和條文明文禁止在目前利用基因編輯技術對計劃出生的胚胎進行基因改造。人類利用基因編輯技術防治疾病的夢想和努力，迄今仍集中在對14天以內的胚胎的科學研究，而不開放任何臨床實踐。這些可貴的科學研究成果，將回答不同基因位點被編輯的難易程度，不同基因編輯技術的靶效應與脫靶效應的相對比值，和一系列有關效率與副作用的問題，為未來人類能夠對自身基因進行修復和改造提供技術和知識儲備[6-8]。

科學技術是中性的，科學技術可以轉化為商業利益，基因編輯相關的基因治療未來也有可能用于針對部分遺傳缺陷的早期胚胎的糾正，但底線是為了人類的健康。在目前，基因治療的臨床實踐可以在體細胞層面開展，而對于生殖細胞則嚴格局限于14天以內的胚胎的科學研究，這是學術界和管理層所認知的體細胞基因治療與生殖細胞基因治療的目前界線。

2 基因編輯嬰兒基因型與HIV感染關系分析

2005年，我們在《CCR5與艾滋病的防治》一文中第一次指出，“就艾滋病患者而言，在治療上，可將其視為再生障礙性貧血或白血病患者看待，通過移植對HIV具有一定抗性的CCR5-Δ32基因型骨髓，達到重建其免疫力的目的。雖然骨髓移植本身對患者體內的HIV病毒并無直接抑制或殺滅作用，但新建立的白細胞系由于其CCR5突變而導致HIV的入胞過程受阻，將有可能使其從艾滋病患者逆向轉化為HIV攜帶者。上述異體骨髓移植存在兩大弱點，即器官移植的排斥反應和CCR5-Δ32基因型骨髓來源的匱乏。雖然歐洲人種中CCR5突變型純合子可高達1%，但因其它疾病、年齡、及捐獻意愿等因素，實際可用的骨髓仍十分有限。與此相反，自體骨髓移植則可克服上述缺陷。因此，就HIV感染者而言，通過對其自身造血干細胞進行CCR5體外致突變，可在更大范圍內受益于HIV患者”[9]。HIV病毒根據其進入白細胞的受體通道，分為R5噬型，X4噬型和混合型。CCR5蛋白是HIV-1中R5噬型進入白細胞的受體，因此，無論是天然發生的突變導致該蛋白功能喪失，還是人工基因工程改造使其失活，都可能具有阻止相關病毒進入白細胞的能力，這是我們2005年提出上述兩種基因干預方案用于治療艾滋病的生物學基礎。需要強調的是，這兩個方案有明確的適應范圍，那就是相關R5噬型的HIV感染者或艾滋病患者[10-11]。

醫學知識對預防和治療在擬達到的目的和需要采取的措施上有所不同：但凡預防，總希望能盡可能杜絕某種疾病的發生，一般所指對象是疾??；而治療，則是針對患病個體。這種預防與治療的差別，決定了CCR5可以有效合理成為治療艾滋病的靶標，而不適宜或不應當作為預防尤其是基因工程手段用于預防HIV感染的靶標[12-13]。除從人群的角度分析之外，就本次基因編輯的雙胞胎，其感染HIV的機會不大，而基因編輯帶來的脫靶效應是難以預知的和肯定的，即使對所選擇靶點達到預期的基因編輯效果，仍然不能提供對HIV的全面抵抗力，所以該臨床實踐與醫學倫理完全相悖，同樣也缺乏技術與科學基礎。

表一羅列了CCR5基因型與表型的可能關系。X4噬型的HIV感染與CCR5沒有密切關系，當CCR5蛋白因該基因的雙拷貝突變導致功能完全喪失時，相關個體則對R5噬型可以產生抵抗力或免疫力。這一點已為多項流行病學數據所支持，同時臨床實踐也通過柏林病人獲得了證明。目前大量開展的造血干細胞體外基因改造基因治療臨床研究，也是基于這一原理。

然而, 在最近報道的基因編輯嬰兒事件中，我們結合已公開的突變信息與已知的胚胎DNA含量分布數據分析認為該雙胞胎嬰兒均是鑲嵌體，其中Lulu的CCR5基因型多態性以CCR5 +/-15為主，不能提供對HIV的抗性；而Nana的CCR5基因型多態性相對更為復雜多樣，以CCR5 -4/+1/+為主。尚無足夠的數據用以分析體細胞基因型?；蚓庉嬘糜诨蚋脑斓膬煞N主要方式是同源重組和非同源末端連接，前者可以對基因進行敲進，敲出，制造特定突變；后者主要用于功能性敲除?；虻墓δ苄郧贸某湟獥l件是：(1)得到移碼突變；(2)并且要求是所有細胞靶點基因的雙拷貝的移碼突變；(3)突變基因轉錄的mRNA不能產生有功能的蛋白分子。

表一列出的信息顯示，鑲嵌體女嬰Nana的細胞構成無法滿足上述充分必要條件的第二點。雖然大部分細胞所帶有的基因型可能滿足第一點，但第三點目前仍無法確認。一般情形下，移碼突變在突變處隨后會很快形成終止密碼子突變，終止密碼子通過在RNA和蛋白質兩個水平發揮作用，使基因功能失活。在RNA水平，非天然終止子通過啟動無義突變介導的mRNA降解，達到阻止蛋白質的翻譯過程。在蛋白質翻譯過程中，終止子通過終止翻譯過程，在中心法則通道的最后環節防止錯誤信使核糖核酸信息向蛋白質轉遞。就CCR5基因而言，是否任意可以移碼突變都可有效失活CCR5蛋白功能，如Nana通過基因編輯形成的四個堿基的缺失和一個堿基的插入，則不可簡單從基因型推測表型。

從人群層面看，對HIV具有最大抗性的CCR5突變為32堿基缺失型，該突變推測為800年前左右發生的一次偶發突變，目前攜帶這一突變的人口數量超過一億人。根據小插入和小缺失的突變規律[14-15]，當一個32堿基缺失發生時，一個堿基缺失的機率則要達一千倍以上，換言之，即可以出現上千次的隨機發生的一個堿基缺失事件，總計一堿基缺失，二堿基缺失，四堿基缺失，和一堿基插入，而堿基插入，隨即發生的頻次可以在1500～2000之間。CCR5的32堿基缺失突變之所以在現代人群中能快速擴散，一種解釋是該突變同時對歷史上多次大規模爆發的天花同樣可能具有抗性。流行病學研究表明，32堿基缺失的單拷貝個體，即表現出一定的對HIV感染的抵抗力。而相應容易高頻發生的那些理論上可以導致閱讀框架移動的小缺失和小插入，并沒有在現代人群中發現，除了這些突變在歷史上沒有發生之外，另一種可能的解釋是這些突變不能或至少單拷貝突變不能為突變攜帶者提供有效的對天花的抵抗能力。CCR5蛋白由一個外顯子編碼，其mRNA上因移碼形成的終止子難以啟動無義突變介導的mRNA降解，而含有小插入和小缺失的mRNA，可能在隨后的翻譯過程中通過翻譯的通讀機制，最后產生具有部分功能或基本正常功能的CCR5蛋白。因此，Nana的-4和+1的小突變，不一定能使CCR5蛋白喪失功能。

表1 基因編輯雙胞胎嬰兒的遺傳特性和抗HIV感染的預期抗性

3 基因編輯脫靶效應的影響

基因編輯沒有完全不脫靶的技術，在現有的幾種常用基因編輯工程核酸酶中，一般認為TALENs較ZFNs脫靶效應低，而CRISPR-cas9脫靶效應相對較高。但是，在實用性方面，后者則具有極大優勢，這是其被廣泛用于動植物和微生物基因組改造的主要原因。這次發生的基因編輯嬰兒事件所采用的基因編輯技術，采用了CRISPR-cas9系統。在技術層面上，cas9采用長度約為20個堿基的gRNA尋找和結合具有互補堿基關系的DNA雙鏈，然后cas9在結合處形成一個雙鏈斷裂切口。理論上，依據設計的與gRNA完全互補的靶點，即可能產生靶效應的基因位點；而與gRNA不完全互補的基因位點，則是潛在的脫靶效應的作用位點。由于CRISPR-cas9系統是微生物進化得到的一套防御體系，從實用的角度出發，這套體系防御效率最大化的一種簡單方式是對與gRNA不完全的外來基因也能識別和破壞。大量基因編輯的實驗研究表明，CRISPR-cas9對與gRNA不完全互補的基因位點，在一堿基，二堿基甚至更多個堿基不互補的條件下均可形成雙鏈切口，這由該系統生物學特性所決定，是該體系用于人類基因治療有待克服的一個巨大障礙[16-19]。

對人以外生物物種的基因改造，最關注的是靶效應，脫靶效應可以通過后續的基因交換方式將靶效應與脫靶效應分離開來。然而，對人的基因治療，由于不可能通過后續的基因交換方式剔除脫靶效應，因此脫靶效應與靶效應的比值，也即藥物研發中的安全系數便成為無法回避的問題。由于上述cas9脫靶效應在基因組上的范圍和對不同脫靶位點的基因編輯程度均具有極大不確定性，因此這一技術即使是在今天醫學倫理已經允許基因編輯胚胎的條件下，也還遠遠未能用于臨床實踐的成熟程度；而目前醫學倫理嚴禁人體胚胎基因改造的任何臨床實踐。

脫靶效應的第一個影響是基因編輯個體的健康。對基因治療而言，基因治療的靶點，一般會選用基因型與表型關系明確的靶點。但是，脫靶效應由于其脫靶的不確定性，可能受影響的基因眾多，當與系統發育成熟的基因被編輯后，個體的生長發育有可能受到不同程度的影響。這種不利影響盡管通過出生后的全基因組測序可以有所預警作用，但由于基因間相互作用的復雜性，尤其是即使可以預知卻不能預防和糾正的負面影響，對基因編輯個體會導致器質性和心理的雙重傷害。脫靶效應對生長發育的影響相對較小，因為這需要脫靶效應設計的細胞數量較多才會有所體現。但是，對腫瘤風險而言，則只需要很少數量的細胞中的抑癌基因或原癌基因受到波及，其風險將會難以估量。

脫靶效應的第二個影響是對人類基因池的長期改變。除非接受生殖細胞基因治療的胚胎發育成人后不孕不育，否則對人類基因池的影響難以完全排除。作為一個物種，人類的基因池在人類生命的進程中保持相對穩定的同時，一直與其他物種的基因組成分具有交流，如現在人類體內含有古尼安特人的基因成分，含有多種病毒類似成分，等等。除編碼必須核糖核酸和蛋白質的基因外，人類基因組中大量結構是由假基因，重復片斷如Alu序列等功能未知或未完全明了的序列組成。這些占人類基因組絕大比重的功能未知的結構，不排除具有像微生物的CRISPR系統一樣可以不停接納外來序列以增強自身對環境適應的能力。生殖細胞基因治療的最理想方式是既能治愈遺傳缺陷又不在人類基因池留下殘余影響。

生殖細胞基因治療對基因池的影響有兩方面基因來源，一方面是用于基因治療的基因材料，另一方面是基因治療手段對人類基因組的不可預知的突變也即脫靶效應的后果。這里顯然存在一個互相矛盾的取舍。若減少基因治療材料對基因池的影響，如基因編輯酶均采用蛋白質而不是核酸，這一策略需要在受精卵和早期胚胎內完成基因修復過程，但其可能導致的脫靶效應會相對廣泛，也因此，由脫靶效應對基因池的影響相應可能會變得更大更危險。

最后需要特別強調的是，脫靶效應對基因池的影響，最終由脫靶效應在生物功能上屬于正向選擇還是中性或負向選擇有關。除了生物學效應外，社會美學價值，在一定程度上可以使負向選擇的生物學效應逆轉為生殖繁育上的正向選擇，這將會帶來災難性后果[20]。

4 生殖細胞基因治療的適應范圍和需要優化的技術路徑

為了避免誤導，這一部分的第一句話開宗明義地指出，生殖細胞基因治療目前只可以對14天以內的胚胎進行科學研究，任何在現階段計劃或實施臨床實踐的行為，都是不可容忍的?；蛑委熂夹g本身的成熟度和人們對基因治療的認可度，決定生殖細胞基因治療可否以及何時可以在倫理上允許臨床實踐。如果基因治療不產生脫靶效應也不對人類基因池產生殘留影響，基因治療將有如物理性手術治療一樣不存在倫理挑戰，和不存在應用范圍受到脫靶效應困擾的多種限制。

在《人類疾病的基因治療》章節中，我們對基因治療的范圍之廣和應用前景，有很樂觀的預期，這種樂觀預期一定程度上得到了二十年內基因治療進步的驗證。而在上述章節中，我們詳細區別了體細胞基因治療與生殖細胞基因治療的差別。生殖細胞基因治療是人類亙古的夢想，最近比較實用的基因編輯技術研究，推動基因治療從體細胞基因治療向生殖細胞基因治療向前邁進了一大步，我們可以更從實際應用層面遙望生殖細胞基因治療和討論其適宜的指征等。由于在可預見的短期未來，我們還難以獲得基因治療成熟度高的成熟技術。因此，對生殖細胞基因治療的適應范圍予以限制和對實施途經予以限制，可以減少對個體和對人類群體的不利影響。

4.1 生殖細胞基因治療的適應范圍

生殖細胞基因治療的適用范圍，或者說應用生殖細胞基因治療的原則，無論是在技術還不成熟的現在，還是在技術更成熟的未來，生殖細胞的基因治療應局限于單基因遺傳病的治療。這一局限基于以下思考或建議，以及還需要對單基因遺傳病有諸多進一步的限制：

(1)局限于基因的治療，而不是基因性狀的優化；(2)局限于遺傳病的治療，而不是感染性疾病的預防，后者應以發展疫苗和藥物作為重點；(3)局限于單基因遺傳病，而不是多基因遺傳??；(4)局限于表型嚴重且除糾正基因外完全沒有其他防治手段的單基因遺傳??；(5)

局限于染色體單基因病而不包括線粒體遺傳病。

4.2 生殖細胞基因治療需要優化的技術路徑

隨著體外生殖技術的進步和顯微操作技術的成熟，在不同細胞間轉移細胞核或轉移線粒體，都已經變成了技術可靠的常規技術。然而，這些操作本身并不涉及對人類基因組的修改，與生殖細胞基因治療有著天然的區別。因此，上述操作，可以在受精卵層面進行，而不會對被處理的受精卵發育的個體產生類似基因治療的脫靶效應的有害影響，也不會對人類基因池產生殘留外源基因的危害。

未來最小化生殖細胞基因治療的脫靶效應對接受基因治療個體和對人類基因池的危害，基因治療的操作過程可以像上述體外生殖過程一樣在受精卵內進行，但是，基因編輯過程，基因修復過程，可以在胚胎發育到一定階段甚至在嬰兒出生后進行。這一建議具有以下諸多特點和優點，可以作為未來生殖細胞基因治療的備選技術路徑：(1)受精卵僅僅作為基因操作工具的儲存載體和被整合受體；(2)被整合的基因治療工具被均等和有效輸送至發育后的胚胎或嬰兒的全身細胞；(3)基因編輯和基因治療可以在產前或產后特定生命階段啟動；(4)基因治療涉及到可能產生新抗原性蛋白的情形，則宜在胚層形成后盡早進行；(5)基因編輯和基因治療可以在特定的一種或為數不多的幾種細胞類型進行，細胞類型特異性啟動子參與這一調控；(6)基因編輯和基因治療的啟動有外源性化學小分子或光熱等物理條件調控；(7)基因操作工具可以自帶從基因組中剔除基因操作工具本身的自清理體系。

5 小結與展望

生殖細胞的基因治療，是人類用自我認識世界的力量對人類自身進行糾錯的千年夢想。隨著基因編輯技術的出現和可實用化，尤其是在多種動植物和微生物物種基因組改造中的成功應用，人類離生殖細胞的基因治療僅有一門之隔了。打開這扇門，需要技術的進一步成熟，和倫理的相應更新，而技術和倫理是互相依存的，在期待生殖細胞基因治療早日惠及人類醫療保健事業過程中，希望有關基因編輯嬰兒的基因與基因組相關分析，能從學術層面上，通過基因治療的靶效應與脫靶效應的討論，能把體細胞基因治療和生殖細胞基因治療清晰的區分開來，促進基因治療的健康發展[21-22]。