HBcrAg在慢性乙型肝炎臨床診療中的研究進展

王施剛，楊 春

(重慶醫科大學附屬第一醫院感染科，重慶400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個全球性問題，全世界約有2.4億慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者[1]。有8%～20%的CHB患者在5年內發展為肝硬化，10%～17%的肝硬化患者在5年內發展為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。被HBV感染的肝細胞的細胞核中存在共價閉合環狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，其導致了治療中斷后高復發率的問題[3]。目前，通常以乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的血清學轉換以及血清HBV DNA水平檢測不出來作為抗病毒治療的終點[3]。然而，即使血清HBeAg轉陰、血清HBV DNA檢測不到后，部分患者仍可能發生肝硬化和肝癌[3]。肝活檢對肝內cccDNA和肝內HBV DNA進行定量檢測能最準確地反映病毒載量，但由于是侵入性檢測方法，存在抽樣誤差，且缺乏標準化的檢測方法，目前在臨床實施較為困難。乙型肝炎核心相關抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)作為HBV感染的一種血清學標志物，其水平可較好地反映HBV DNA和肝內cccDNA的情況[4]。HBcrAg檢測方法簡便、臨床可操作性強，具有良好臨床應用前景?，F就HBcrAg在CHB中的研究進展進行綜述。

1 HBcrAg的組成及檢測方法

HBcrAg是HBV感染的一種血清學標志物，由HBeAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)以及一種核心相關蛋白(p22cr)組成，主要在不含HBV DNA的病毒顆粒中發現[5]。HBcAg、HBeAg以及p22cr均是前c/c區的編碼產物，有相同的149個氨基酸序列[4]。HBV進入肝細胞內，并在細胞核中形成穩定的cccDNA后，HBV開始轉錄形成各種信使RNA(messenger RNA，mRNA)。這些mRNAs編碼各種結構和非結構蛋白。HBcAg是病毒衣殼的結構成分，可在成熟病毒體中發現。HBeAg是一種非結構性HBV蛋白，是前c區N端加工產物。與HBeAg一樣，p22cr也是一種前c區核心蛋白的加工產物，且可以存在HBV DNA陰性和HBcAg缺乏的Dane樣顆粒中。

目前主要采用化學發光酶免疫分析檢測HBcrAg[6]。因HBcAg、HBeAg和p22cr具有相同的氨基酸序列，故一株單克隆抗體即可檢測這3種蛋白質。將血清樣品與抗HBcrAg包被的微孔板混合形成抗原-抗體免疫復合物，再用堿性磷酸酶標記的抗HBcrAg結合微孔板上的免疫復合物，最終形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，通過測定復合物的發光強度定量樣品中HBcrAg的含量。該方法檢測的下限為2.0 lgU/mL，線性范圍為3.0～7.0 lgU/mL(1 kU/mL=3 lgU/mL)。對于HBcrAg>7 lgU/mL的樣品，可通過樣品稀釋來定量HBcrAg的水平。

2 HBcrAg與肝內cccDNA和HBV DNA的關系

目前，肝內總HBV DNA與肝內cccDNA的相關性最強(r=0.83，P<0.000 1)，血清HBcrAg、HBV DNA與cccDNA的相關性較強(r均=0.70，P<0.000 1)，乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)與cccDNA的相關性較弱(r=0.40，P<0.000 1)[7]。肝內HBV DNA的檢測受肝活檢的限制。接受核苷酸類似物[nucleotide analog，NA(s)]治療的患者，在1年的時間內通常檢測不到血清HBV DNA。因此，不能使用血清HBV DNA作為cccDNA的替代指標，用血清HBV DNA反映cccDNA含量的可靠性也較差[7]。理論上，HBsAg是反映病毒活性和肝內cccDNA水平的血清標志物，但在接受NA(s)治療的患者中，即使HBV DNA檢測不到時，HBsAg仍可檢測到，HBsAg與cccDNA只有弱相關性[8]。與cccDNA相關性較弱的一個原因可能是肝內HBV的復制率較低，此外也存在大量循環空HBsAg顆粒。HBsAg與cccDNA的弱相關性在其他研究中也有報道[9]，因此HBsAg并不是一個較理想的cccDNA替代指標。

盡管肝內總HBV DNA、血清HBV DNA以及HBcrAg均與cccDNA具有良好的相關性，但HBcrAg與前兩種標志物相比具有一定的優勢。與血清HBV DNA一樣，測量HBcrAg不需要肝活檢，因此較肝內HBV DNA測量更有可行性。此外，HBcrAg測量相對于血清HBV DNA也具有優勢，即使血清HBV DNA檢測不到時大部分患者仍可檢測到HBcrAg。在305例接受NA(s)療法的患者中有130例患者檢測不到血清HBV DNA，進一步對這130例患者進行分析發現，78%的患者可檢測到HBcrAg，且HBcrAg與cccDNA呈正相關(r=0.42，P<0.000 1)[7]。綜上，在HBV的標志物中，HBcrAg是最適合反映肝內cccDNA水平的標志物。

無論是在臨床還是實驗室環境中，HBcrAg的檢測都很方便。與血清HBV DNA檢測不同，HBcrAg檢測不需要使用聚合酶鏈反應擴增技術。同時，HBcrAg檢測所需的血清樣本量(150 μL)也低于大部分血清HBV DNA檢測所需的血清樣本量(通常為0.5～1 mL)[7]。

3 HBcrAg有助于確定CHB的階段

對于HBeAg陽性患者，較低的HBcrAg水平提示患者處于強烈的免疫控制之下[10]。Seto等[10]研究發現，HBeAg陽性的HBV感染者和HBeAg陽性的CHB患者HBcrAg的水平分別為8.54 lgU/mL和7.92 lgU/mL，兩者比較差異有統計學意義，但HBcrAg水平能否反映免疫清除活性還需要進一步研究。此外該研究還發現，HBeAg陽性者HBcrAg的水平高于HBeAg陰性者[10]，這與HBeAg血清轉換后HBeAg的產生減少有關。與HBeAg陽性者不同，若HBeAg陰性者(盡管HBcrAg的水平低于HBeAg陽性者)在HBeAg血清轉換后仍有較高的HBcrAg水平，提示患者免疫清除水平較低。研究表明，HBeAg陰性HBV感染者HBcrAg的水平明顯低于HBeAg陰性的CHB患者(2.60 lgU/mL比4.92 lgU/mL，P<0.001)；與HBeAg陰性的HBV感染者相比，HBeAg陰性CHB患者的HBcrAg水平升高，與更明顯的壞死性炎癥和纖維化有關[11]。

另外，對于發生了HBsAg血清學轉換的55例患者來說，71%的患者無法檢測到血清HBsAg的水平，這表明病情較為穩定，但仍可在12例患者的血清中檢測到HBcrAg，其HBcrAg的中值為2.7 lgU/mL[10]。HBsAg的血清清除并不意味著HBV的清除。有研究發現，對發生HBsAg血清轉換的CHB患者進行肝活檢仍可檢測到cccDNA，且有46.2%(6/13)的患者血清HBcrAg陽性[12]。

上述發現為HBcrAg進一步確定CHB的感染階段提供了潛在的證據。最新歐洲肝病學會指南指出，HBcrAg有助于確定慢性HBV感染的階段，尤其是HBeAg陰性者[13]。目前各階段劃分的最佳截止值仍有待確定，未來期待有更多大樣本、更長周期的前瞻性研究進一步探索。

4 HBcrAg檢測的臨床意義

4.1對抗病毒治療的監測

4.1.1聚乙二醇干擾素治療 聚乙二醇干擾素可調節免疫力，直接抑制病毒，還可以抑制病毒DNA和cccDNA的復制。病毒HBcrAg的動態變化可以評估聚乙二醇干擾素治療CHB的效果。Chuaypen等[14]對46例接受聚乙二醇干擾素處理48周的HBeAg陽性CHB患者外周血中HBcrAg的水平進行動態監測發現，15例(32.6%)患者在治療24周后出現病毒學應答(定義為HBeAg清除和HBV DNA <2 000 IU/mL)。與無應答者相比，應答者cccDNA顯著下降，基線HBcrAg水平與cccDNA相關(r=0.564，P=0.001)，治療期間相應標志物的變化與cccDNA的減少相關(r=0.503，P=0.005)；與無應答者相比，應答者在治療期間HBcrAg的水平下降更快，且與cccDNA一致；多變量分析顯示，第12周時血清HBcrAg的水平是病毒學應答的預測因子，HBcrAg的最佳臨界值是8 lgU/mL。治療12周和24周時病毒學應答的陰性預測值(negative predictive value，NPV)分別為94.4%和100%。因此可根據HBcrAg的水平預測CHB患者對抗病毒治療的反應。

對于HBeAg陰性的CHB患者，定量HBcrAg已被提議作為定量HBsAg的額外標志物。Chuaypen等[15]對121例HBeAg陰性的CHB患者進行48周聚乙二醇干擾素單獨或與恩替卡韋聯合治療。持續病毒學緩解(持續HBV DNA<2 000 IU/mL)和治療3年后HBsAg的清除率分別為29%(35/121)和9%(11/121)；基線HBcrAg與HBV DNA和cccDNA相關，但與HBsAg無關；基線HBsAg的水平以及HBsAg和HBcrAg的下降與持續病毒學緩解相關，而HBsAg的下降可預測HBsAg的清除率；高基線抗原水平(HBsAg≥3 400 IU/mL以及HBcrAg≥3.7 lgU/mL)導致高的持續病毒學緩解陰性預測值和HBsAg清除率[15]。Martinot-Peignoux等[16]對62例HBeAg陰性CHB患者使用聚乙二醇干擾素單獨或聯合替諾福韋酯治療，隨訪發現，基線血清HBcrAg水平預測治療1年的持續病毒學應答的受試者工作特征曲線下面積是0.668，臨界值為3.45 lgU/mL時的陰性預測值是72%，HBcrAg與HBsAg聯合時受試者工作特征曲線下面積可達0.745[16]。定量HBcrAg與HBeAg陰性CHB患者的cccDNA顯著相關，與HBsAg聯合可以識別長期隨訪中持續病毒學緩解和HBsAg清除率低的患者[16]。

4.1.2核苷酸類似物治療 治療前，HBeAg陽性或陰性的CHB患者均可檢測到HBcrAg，HBeAg陰性者HBcrAg的水平低于HBeAg陽性者[17]。雖然HBcrAg與HBV載量高度相關，但抗病毒治療后HBcrAg的下降與HBV DNA相比并不太明顯。NA(s)治療期間血清HBV DNA的水平低于最低檢測限時，大部分患者的HBcrAg仍可檢測[7]。兩者的差異可用NA(s)對逆轉錄和HBV DNA復制的抑制來解釋，而HBcrAg是由cccDNA轉錄的mRNA翻譯產生，故HBcrAg的產生不受抗病毒藥物的影響[18]。對94例接受過8年連續NA(s)治療的患者進行研究發現，無論是HBeAg陰性還HBeAg陽性者，血清定量HBcrAg的水平從基線到第8年呈現逐年下降的趨勢[19]。經過8年的NA(s)治療后，根據血清HBcrAg和HBsAg評分系統危險分層規律，只有3.2%的患者可達到NA(s)戒斷后低復發風險的標準，說明目前長期NA(s)治療是必要且重要的[19]。

4.2對病情復發和耐藥性的預測 由于NA(s)不能直接抑制cccDNA，部分患者在停藥后易復發，因而必須長時間服用藥物，甚至終身服藥[20]。在長期抗病毒治療期間，一些患者可能發生與耐藥相關的基因突變，從而導致HBV DNA重新出現，肝炎復發，甚至發生肝功能衰竭。因此，預防患者產生耐藥以及停藥后復發非常重要。HBcrAg可能是監測藥物耐藥和停藥后復發的潛在生物標志物。

血清HBcrAg的水平可預測病情復發，特別是對于HBeAg陰性的CHB患者[13]。對113例達到NA(s)停藥標準后停藥的CHB患者進行隨訪發現，停止NA(s)治療后1年內有63例患者發生病毒學復發，其血清HBcrAg水平較未復發者高，故血清HBcrAg較血清HBV DNA能更好地評價、預測CHB患者停藥后復發[21]。NA(s)治療結束時HBcrAg>3.7 lgU/mL是預測病毒學復發的獨立危險因素(OR=3.751；95%CI1.187～11.856，P=0.024)。Matsumoto等[22]對34例停用拉米夫定治療的CHB患者進行隨訪發現，無論HBeAg陽性還是陰性患者，復發者HBcrAg的水平較未復發者高(HBeAg陰性：4.8 lgU/mL比3.0 lgU/mL，P<0.05；HBeAg陽性：5.9 lgU/mL比5.6 lgU/mL，P>0.05)，但是復發組與未復發組血清HBV DNA水平差異無統計學意義。進一步研究發現，血清HBcrAg>3.0 lgU/mL的CHB患者在停用NA(s)治療后1年內乙型肝炎的復發率為90%(47/53)，且復發率隨著HBcrAg水平的升高而升高[23]。因此，CHB患者治療結束后對血清HBcrAg的水平進行動態監測可幫助識別復發的高風險人群，從而可對高危人群進行有針對性的密切隨訪。

對采用拉米夫定治療的CHB患者進行研究發現，治療2年時HBV DNA>2.6 log拷貝/mL的患者的耐藥率明顯高于HBV DNA≤2.6 log拷貝/mL者(P<0.001)，且血清HBcrAg的水平降低的慢于血清HBV DNA，治療后HBcrAg的水平較低者更不易發生耐藥，血清HBcrAg<4.7 lgU/mL的患者未出現耐藥情況。81例CHB患者接受拉米夫定治療半年后發現，血清HBV DNA陰性者56例，隨訪2年發現30%的患者出現耐藥[24]。以上研究表明，血清HBV DNA測量對于鑒定拉米夫定耐藥高風險人群是有價值的；而血清HBcrAg測量對于鑒定拉米夫定耐藥低風險人群同樣也具有價值。對50例采用聚乙二醇干擾素聯合NA(s)治療[聚乙二醇干擾素聯合NA(s)治療4周后聚乙二醇干擾素治療20周，共治療24個月]的CHB患者進行研究發現，治療開始時HBsAg高水平(>3.0 lgU/mL)和HBcrAg高水平(>4.5 lgU/mL)是完成治療時無應答、無HBeAg血清轉換的重要預測因素[25]。綜上，血清HBcrAg的水平反映的是肝細胞內cccDNA的水平，其對于篩選CHB抗病毒藥物的耐藥性方面有重要作用，可用于預測抗病毒的療效。

4.3對肝癌及肝移植患者的病情評估 HBcrAg檢測對HCC的發生具有重要預測價值[26-28]。對未接受治療的CHB患者進行平均10.7年的隨訪發現，HBcrAg預測HCC的發病優于血清HBV DNA和HBeAg，HBcrAg>2.9 lgU/mL是HCC發生的獨立預測因子(HR=5.05，95%CI2.40～10.63)[26]。對于接受治療的患者，NA(s)治療后HBcrAg陽性至少2年是HCC的獨立危險因素[27]。76例CHB患者采用NA(s)治療后均檢測不到血清HBV DNA，與未發生HCC患者相比，HCC組治療前HBcrAg水平顯著增高(5.45 lgU/mL比4.55 lgU/mL，P=0.005)。治療前HBcrAg>4.67 lgU/mL和治療后HBcrAg>3.89 lgU/mL均能獨立預測HCC[28]。HBcrAg也被用來預測HCC切除或射頻消融后的復發。對NA(s)治療期間發展為HCC并進行根治性切除術或經皮消融治療的患者研究發現，血清HBcrAg>4.8 lgU/mL時，2年內HCC復發的危險比為8.96(95%CI1.94～41.4)[29]。

肝移植可用于治療HBV感染相關的肝硬化和肝癌，由于肝外器官并未完全清除HBV，因此肝移植后需要終身抗病毒治療。對于此類患者，因為已經慢性感染，故治療的目標是防止移植物復發肝炎。在肝移植患者中，雖然HBcrAg與肝內cccDNA存在顯著相關性(r=0.616，P<0.001)[30]，但HBcrAg在預測HCC復發、HBV再感染方面的作用尚待確定。Urabe等[31]對21例肝移植前患有HCC的患者進行隨訪發現，肝移植后有5例出現HCC復發(HBcrAg陽性的14例中有2例復發，HBcrAg陰性的7例中有3例復發)，HBcrAg陽性與肝移植后HCC的復發風險無顯著相關性。對32例肝移植患者進行隨訪發現，有6例出現HBsAg和(或)HBV DNA，16例(50%)檢測到HBcrAg[31]。未來可進一步探索HBcrAg是否可以作為肝移植后乙型肝炎免疫球蛋白和NA(s)治療停止的標志。

4.4對使用免疫抑制劑人群HBV再激活的預測 對于隱匿性HBV感染者，如果使用免疫抑制治療或接受造血干細胞移植有HBV再激活的風險[32-33]。隨訪63例接受利妥昔單抗化療的患者發現，治療2年時觀察到26例患者發生了HBV再激活，其再激活率高達41.5%[32]。另有研究隨訪了62例接受造血干細胞移植的患者，2年時HBV累積再激活率為40.8%[33]。對接受利妥昔單抗化療或造血干細胞移植的124例亞洲患者進行研究發現，基線HBcrAg陽性是HBV重激活的一個重要危險因素，與HBcrAg陰性患者相比，血清HBcrAg陽性超過2年時HBV再激活率顯著更高(P=0.002)[34]。2017年的歐洲肝病學會指南建議，對于HBV再激活風險中等(<10%)或較低(<1%)的單項抗-HBc陽性患者，在接受免疫抑制治療時，推薦每1～3個月監測HBsAg和(或)HBV DNA，一旦檢測到HBsAg或HBV DNA逆轉，立即開始抗病毒治療[13]。HBcrAg可能在加強HBsAg或HBV DNA監測甚至預防性抗病毒治療中發揮作用，未來需要進一步研究上述人群中HBV再激活的最佳監測指標，并確定開始治療的最佳時間點。

5 小 結

HBcrAg作為非侵襲性指標，是肝內cccDNA的良好替代物，通過檢測患者的血清標本即可獲得，有助于確定CHB疾病的階段，可準確反映CHB患者抗病毒治療效果，預測CHB患者復發、耐藥性以及HCC的發生。未來需進一步探索HBcrAg在肝移植患者中預測HCC復發、HBV再感染以及使用免疫抑制劑治療的CHB患者中的作用。HBcrAg作為一項新的指標，在臨床常規使用之前需要進行更廣泛的臨床驗證。相信隨著醫療技術的發展，未來會有更多關于HBcrAg的臨床應用證據，并逐漸被人們所認可。