多光子皮膚成像技術及其應用

應亞宸，張廣杰*，賈薈琳，陸政元，石玉潔，席 鵬

(1.北京大學 工學院 生物醫學工程系，北京 100871；2．北京大學 元培學院，北京 100871)

1 引 言

組織成像能為組織病理診斷提供直觀的依據，在醫學病理檢查中有著重要的地位。傳統的醫學病理檢測通常需要切取一定大小的病變組織，其制作病理切片，最后用顯微鏡進一步檢測病變組織，檢測過程耗時較長，并且會為患者帶來額外的痛苦。近幾十年來，有大量的研究者致力于開發新型組織成像技術，活體光學成像由于具有無創性、成像實時性、可對統一組織區域進行長時間監測等優勢[1]，成為研究的熱點?，F在常見的組織光學成像技術有熒光成像、光聲成像[2]、光學相干層析成像(OCT)[3]等。

1990年，Winfried Denk[4]等人創造性地提出了雙光子熒光顯微的概念，繼而發展出多光子熒光成像技術，為活體組織光學成像提供了新的思路。相較于傳統的單光子共聚焦熒光成像技術，多光子熒光成像具有以下優勢：(1)激發光波長更長，在組織中的散射系數較小，具有很好的組織穿透性，能夠探測到更深的組織結構；(2)多光子成像的聚焦性好，焦平面外的熒光分子幾乎不被激發；(3)多光子技術的激發光光子能量更低，細胞毒性小，對組織的損傷更少，具有很好的安全性[1]。因此，多光子技術在活體組織成像，尤其是皮膚組織的成像中得到了廣泛的使用。近年來，該技術也取得了產業化的成果：JenLab[5]已經推出基于多光子層析成像的皮膚檢測系統，在早期皮膚癌癥診斷、皮膚衰老檢測等方面均有著應用。本文將介紹多光子皮膚檢測系統的主要技術原理，以及其在皮膚組織病理性檢測中的一些應用，并簡要探討這項技術的優勢與未來的發展趨勢。

2 多光子皮膚檢測系統的構成

多光子皮膚檢測系統基于雙光子自發熒光、二次諧波成像、熒光壽命成像等技術，可以實現皮膚組織結構與功能上的成像[6]。同時，相干反斯托克斯-拉曼散射光譜成像技術也被應用到該檢測系統中，以實現皮膚組織中非熒光物質(如脂質)的成像[7]。

2.1 雙光子自發熒光

雙光子自發熒光指基態熒光分子或原子吸收兩個光子激發至激發態，然后恢復到基態并發出熒光的過程。熒光分子在吸收第一個光子后，將躍遷至一個虛態，需要第二個光子在幾飛秒內與處于虛態的熒光分子作用，熒光分子才能從虛態躍遷到激發態[4]。

圖1 主要內源熒光分子的(a)激發光譜；(b)發射光譜[10] Fig.1 (a)Excitation spectra; (b)emission spectra of primary endogenous fluorophores[10]

自發熒光物質是指生物細胞與組織內固有的熒光物質。當被合適波長的光激發時，一些細胞和組織的內容物能夠發出穩定的熒光信號，它們也因此被稱為內源熒光團[8]。一些內源熒光團分子(圖1)廣泛分布于細胞和組織之中，例如NAD(P)H、卟啉類化合物、黃素、黑色素等。皮膚組織中NAD(P)H的含量與皮膚組織細胞內氧化還原與新陳代謝水平相關，可作為皮膚衰老檢測的分子標志物[9]；皮膚黑色素瘤會使黑色素細胞的形態與邊界發生變化。因此，可以用多光子無標記成像實現對于皮膚疾病的早期探測以及對皮膚衰老的檢測。

在多光子皮膚檢測中，用于成像的主要內源熒光團有角質層中的角質蛋白、顆粒層中的NAD(P)H、基底層中的黑色素、真皮層中的膠原蛋白與彈性蛋白等。由于多光子技術具有很好的共聚焦效應，使用該技術可以獲得不同深度的皮膚組織自發熒光成像(圖2)。上述熒光團的單光子激發光波長大多位于紫外光波段(340～400 nm)，會對皮膚組織造成很大的損傷；而使用雙光子激發則只需近紅外光(700～850 nm)，光子能量較低，大大減小了對活體組織的傷害[11]，也降低了光漂白對熒光成像的影響。同時，自發熒光成像技術使得皮膚組織在成像時不需要外源熒光團的標記，在臨床應用上更加方便、安全。

圖2 健康人體皮膚活體成像，激發光波長760 nm：(a)角質層，0 μm深：角蛋白自發熒光信號；(b)顆粒層，20 μm深：角質細胞中的透明角質顆粒、NADPH、角蛋白自發熒光信號；(c)棘層，30 μm深：角質細胞密度增大；激發光波長800 nm; (d)真皮層，85 μm深：膠原蛋白、彈性蛋白自發熒光信號[11] Fig.2 In vivo healthy human skin imaging with excitation wavelength of 760 nm:(a)Stratum corneum, 0 μm depth: auto-fluorescence signal of keratin; (b)Stratum granulosum, 20 μm depth: auto-fluorescence signal of keratohyalin granules, NADPH, and keratin in keratinocytes; (c)Stratum spinosum, 30 μm depth: increased cellular density of keratinocytes; 800 nm excitation wavelength: (d)Dermis, 85 μm depth: auto-fluorescence signal of collagen and elastin[11]

圖3 (a)雙光子激發熒光(2PEF)和(b)二次諧波成像(SHG)的Jablonski圖[12] Fig.3 Jablonski image of (a)two-photon excitation fluorescence(2PEF) and (b)second harmonic generation(SHG)[12]

2.2 二次諧波成像

二次諧波成像是一種非線性的光學過程，在此過程中，兩個相同頻率光子與非對稱介質發生相互作用，將其從基態激發至虛態。在從虛態恢復到基態的過程中，釋放頻率增倍、波長減半的光子(圖3)。由于其可將物質自發激發至虛態的特性，二次諧波成像不需要熒光標記，因此不會受到光漂白或光毒性的影響。與雙光子熒光激發不同的是，二次諧波成像中，被激發物體吸收的能量和放出的能量大小相同，因此，若對同一物質進行雙光子熒光成像與二次諧波成像，所得的成像信號會出現在不同的頻率范圍。

圖4 真皮層中膠原蛋白纖維的SHG信號(藍)與彈性蛋白纖維的自發熒光信號(綠)[14] Fig.4 SHG signal of collagen fibers(blue) and autofluorescence signal of elastic fibers(green) in the dermis(Scale bar:20 μm)[14]

在生物體中，SHG成像多發生在細胞的非對稱結構上，如膠原蛋白、微管蛋白等。在皮膚活體成像中，SHG成像也有著重要的應用。通常使用波長為800 nm左右的激發光，對如真皮層中的膠原蛋白和彈性蛋白網絡進行成像[4]。如圖4所示，綠色熒光信號是真皮層中彈性蛋白的自發熒光信號，藍色熒光信號是膠原蛋白纖維的SHG信號。與自發熒光相同的是，這些蛋白的微結構與皮膚疾病的發展密切相關，有研究表明，在皮膚表淺性基底細胞癌中，膠原蛋白纖維的排布狀態與正常皮膚不同[13]。因此SHG提供了另外一種監測疾病的成像模態。

2.3 熒光壽命成像

熒光壽命指分子受光脈沖激發后返回基態之前在激發態平均停留的時間，即激發停止后，分子的熒光強度降到激發時最大強度的1/e所需的時間。由于多光子成像需要采用脈沖飛秒激光器，因此特別適合于提取熒光壽命信號。熒光壽命與熒光的初始強度無關，而和熒光分子所處的微環境有關。熒光壽命通常使用時間相關單光子計數(TCSPC)技術來測量，可以達到皮秒級的分辨率[1]。熒光壽命成像就是將不同熒光壽命進行可視化區別的技術。由于熒光壽命和熒光分子所處的微環境條件、與蛋白的結合、輔酶的代謝能力等一系列組織生理因素有關，熒光壽命成像技術為組織生理情況的檢測(如是否可能患有癌癥)提供了可能[15]。例如，Yuri Dancik[16]等人結合多光子斷層成像與熒光壽命等技術，對亞洲與非洲人種的皮膚顆粒層與基底層進行成像(圖5)，發現亞洲人種皮膚顆粒層的分子熒光壽命顯著高于基底層以及非洲人種，研究者此后也分析了色素含量與熒光壽命以及熒光強度的相關性，并由此計算出了亞洲人種與非洲人種不同皮膚組織深度中黑色素含量的關系，即非洲人皮膚中的黑色度含量約為亞洲人的4～5倍。

圖5 不同深度皮膚組織自發熒光強度影像與熒光壽命影像對比. 亞洲志愿者的：(a)顆粒層、(b)基底層；非洲志愿者的：(c)顆粒層、(d)基底層[16] Fig.5 Contrast of auto-fluorescence intensity maps and lifetime color maps:Asian volunteer′s (a)stratum granulosum; (b)stratum basal; African volunteer′s (c)stratum granulosum; (d)stratum basal[16]

2.4 相干反斯托克斯-拉曼散射成像

前面提到的雙光子自發熒光技術、二次諧波成像技術和熒光壽命成像技術在對某些非熒光物質，如脂質等的成像中存在一定的限制?；诶⑸涞某上窦夹g能夠提供這些非熒光物質的信息，并且具有很好的分子識別度[7]。

相干反斯托克斯-拉曼成像是一個三階非線性光學過程，需要抽運激光束、斯托克斯激光束以及探測激光束等3種激光束與同一樣品發生作用，最后產生相干光學信號(圖6)。由于共振激發作用，相干反斯托克斯-拉曼(CARS)能夠比線性拉曼過程提供更強的信號[7]；同時，CARS信號波長相對激發光有明顯藍移，因此，這項技術具有高峰值、高靈敏度的特點。CARS已經應用于皮膚活體成像系統中，主要提供皮膚組織中脂質分布的成像(圖7)。鱗狀細胞癌(SCC)能夠使皮膚細胞形態發生變化，在CARS成像中無法觀察到清晰的細胞邊界，與正常的皮膚組織成像存在區別，因此CARS成像可作為SCC的一種輔助診斷方式[17]。

圖6 相干反斯托克斯-拉曼(CARS)的Jablonski圖:(a)拉曼散射; (b)受激拉曼散射; (c)相干反斯托克斯-拉曼 Fig.6 Jablonski image of coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS):(a)Raman Scattering; (b)Stimulated Raman Scattering; (c)Coherent Anti-Stokes Raman Scattering

圖7 健康人體皮膚活體成像:(a)CARS成像信號; (b)雙光子激發熒光/SHG成像信號; (c)CARS-雙光子激發熒光/SHG成像信號疊加[7] Fig.7 In vivo skin imaging of healthy people:(a)CARS imaging signal; (b)two-photon excitation fluorescence/SHG imaging signal; (c)signal overlay of CARS- two-photon excitation fluorescence/SHG imaging[7]

3 產業化及應用

圖8 JenLab的多光子皮膚檢測系統MPTflex[5] Fig.8 Multi-photon skin screen system of JenLab—MPTflex[5]

德國JenLab公司已經實現了多光子皮膚檢測技術的產業化(圖 8)。其產品使用近紅外飛秒激光脈沖對皮膚組織進行照射，可得到自發熒光、SHG、CARS的3種成像信號，形成對皮膚組織結構成分的圖像；同時，利用熒光壽命成像技術能夠得到皮膚組織的微環境信息，以分析活體組織的生理、病理性狀況[3]。由于雙光子技術具有很好的共聚焦效應，且長波長光具有較小的吸收和散射系數，這一系統能夠得到深度范圍較大(能夠達到幾百微米級別)的光學層析成像，因此能夠檢測分析皮膚組織各個層次的結構與生理情況。同時，近紅外光對生物組織和熒光團的損傷均極小[1]，因此這一系統具有很好的安全性與無創性，并大大減輕了光漂白對熒光成像的影響。

多光子皮膚檢測系統在早期皮膚癌癥影像診斷、皮膚衰老檢測等方面均發揮著一定的作用[18]，下面以檢測皮膚衰老為例，簡要介紹該檢測系統的應用。

在人體皮膚衰老的過程中，真皮層中的膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的形態、網絡結構會發生改變。同時，膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的分布也會發生改變[11]。圖9展示了在多光子層析成像中，纖維形態與伸展的不同狀態，SHG信號由膠原蛋白纖維產生，自發熒光信號由彈性蛋白纖維產生。

圖9 不同纖維形態的多光子層析成像圖對比(左：SHG信號；右：自發熒光信號)[19] Fig.9 Contrast of different fiber morphology MPT images (left: SHG signal; right: auto-fluorescence signal)[19]

在SHG成像中，衰老皮膚真皮層的膠原蛋白纖維呈絲狀(圖9(a1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維卻是不定型的(圖9(a2))。這可能是由于年輕皮膚真皮層中的膠原蛋白纖維含量豐富，纖維組織緊實致密，因而呈現出不定型的外表；而衰老皮膚中的膠原蛋白含量減少，排列較為稀疏，因此呈現出絲狀。同時，衰老皮膚真皮層中的膠原蛋白表現為彎曲伸展(圖9(c2))，中年皮膚的膠原蛋白表現為直線伸展(圖9(c1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維排列致密，難以分辨伸展情況。在自發熒光成像中，衰老皮膚真皮層中的彈性蛋白纖維排列結構混亂(圖9(b2))，并且彎曲伸展(圖9(d2))；而年輕皮膚中的彈性纖維具有良好的網絡結構(圖9(b1))，且直線伸展(圖9(d1))[19]。對于膠原蛋白纖維和彈性蛋白纖維的分布，年輕皮膚真皮層中兩者信號呈均勻的散狀分布，而在衰老皮膚真皮層中，彈性蛋白纖維信號大大增強，而膠原蛋白信號僅能在基底膜下很小的區域被檢測到[20]。這也與隨著皮膚衰老，膠原蛋白纖維減少而彈性蛋白纖維增多的組織學結論相符合[10]。

4 結 論

多光子皮膚檢測技術具有諸多優點。首先，多光子技術具有很好的共聚焦特性，因此能夠對皮膚組織進行較好的層析成像；其次，雙光子熒光技術需要的激發光波長為普通單光子激發波長的兩倍，能量較低，對組織的損傷小，使安全的活體檢測成為可能；同時，較長波長的光具有較小的散射與吸收系數，相比一般的共聚焦技術，能夠探測到更深的組織結構；最后，該技術將熒光強度的探測成像與熒光壽命的探測成像結合起來，不僅能夠對組織內部物質的形態進行成像，也能分析組織的物質組成、代謝以及生理病理情況，實現多種模態的結合，使得檢測結果更具有應用價值。

當然，此技術也存在一些不足。由于熒光壽命成像相對傳統熒光成像而言所需的時間較長，在成像期間，被檢測者必須保持完全靜止不動才能獲得較好質量的圖像[11]。因此，縮短成像的時間能改善圖像質量，并提高患者的就醫體驗。同時，此系統的單次成像區域相對臨床上實際待檢區域(例如皮膚損傷區域)而言面積較小，若能開發算法實現圖像的連續獲取與自動整合，實現較大區域范圍內的皮膚成像[11]，將對臨床診斷大有裨益。

多光子皮膚檢測系統也可通過結合其他種類的影像技術，實現更多模態的檢測。例如中國科學院深圳先進技術研究院醫工所生物醫學光學與分子影像研究室在2016年實現了光聲、雙光子、二次諧波成像3種技術的集成，成功對皮膚組織的微血管、細胞、膠原纖維進行了無標記在體成像[21]，為皮膚組織的臨床檢測提供更全面的生理信息。此外，該系統也可通過進一步集成皮膚血管血流量、血氧檢測等手段，為病理檢測提供關鍵的生物特征信息。最后，在智能醫療快速發展的今天，將此多光子皮膚檢測系統與機器學習、圖像自動分割相結合，實現一些病灶的自動檢出，輔助醫生進行診斷，不失為此類醫學影像系統的未來發展方向之一。