脂聯素對高糖條件下視網膜血管內皮細胞增殖、遷移和管腔形成的作用

李 蓉，姚國敏，王小娣，姚 楊

作者單位:(710077)中國陜西省西安市，西安醫學院第一附屬醫院1眼科;2中心實驗室

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴重且最常見的并發癥之一［1］。在DM的進展過程中，高血糖導致慢性微血管損傷，使得約1/10的患者出現增生性DR(proliferative DR，PDR)或糖尿病性黃斑水腫，嚴重威脅患者視力［2］。隨著生活水平的提升，DM的發病率逐年攀升［3］，但針對DR目前仍缺乏有效的治療方法或藥物。根據病程發展的不同階段，DR分為早期的非增生性DR(non－proliferative DR，NPDR)和晚期的PDR［4］。PDR的標志就是形成視網膜新生血管，其血管結構非常脆弱且易滲漏，最終導致不可逆的視網膜損傷和盲目［2，5］。因此，抑制血管生成就成為了近年來具有前景的DR治療策略［6］。

脂聯素(adiponectin，APN)是由脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性蛋白質。臨床發現血清APN濃度降低與肥胖和2型DM的發生有關，APN通過直接代謝和胰島素增敏作用在各種組織中發揮有益的抗DM作用［7－9］。在缺血性視網膜病變的動物模型中發現，過表達APN可明顯減少缺氧誘導的病理性視網膜新生血管，認為APN是視網膜病理性微血管形成的負向調控者，對視網膜血管損傷起著保護作用［10］。然而，目前對于血清APN 水平與 DR 的關系尚無定論［11－13］，APN 對高糖誘導的視網膜新生血管形成的作用也不清楚。鑒于此，本研究利用高糖刺激條件下的RF/6A細胞觀察APN對其增殖、遷移及管腔形成過程的影響，為明確APN對DR的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 恒河猴脈絡膜視網膜血管內皮細胞(RF/6A細胞)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;1640培養基、0.25%胰酶均購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Invitrogen公司;青霉素、鏈霉素購自美國Hyclong公司;APN購自金斯瑞生生物科技有限公司;CCK－8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;Transwell小室、Matrigel基質膠均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 將 RF/6A細胞置于1640培養基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和 100μg/mL鏈霉素)中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下常規培養。當細胞的密度達到80%時，用0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，用PBS將細胞潤洗2次，1200r/min，離心3min，加入培養基吹打細胞，制成單細胞懸液，按1∶3的比例傳代，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下擴大培養。將RF/6A細胞分為空白對照組、甘露醇對照組、高糖組、高糖+APN組。處理方法:空白對照組細胞采用正常培養基培養;甘露醇對照組細胞采用含20mmol/L甘露醇的培養基培養;高糖組細胞采用含25mmol/L D－葡萄糖的培養基培養;高糖+APN組細胞采用含25mmol/L D－葡萄糖+10μg/mL APN的培養基培養。

1.2.2 CCK－8法檢測細胞活性 將處于對數生長期的細胞消化后，配制成 5×104個/mL的單細胞懸液，每孔100μL，將細胞均勻接種至96孔板中，同時設置空白孔，周圍孔加入100μL PBS，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養。按照分組條件處理48h后，向每孔加入 10μL CCK－8溶液，37℃ 培養 4h，振蕩 10min，用酶標儀(美國Thermo scientific，MK3型)測定各孔在450nm處的吸光值(A)。細胞增殖率(%)=(A實驗組－A空白孔)/(A空白對照組－A空白孔)×100%。

1.2.3 Transwell小室實驗檢測細胞遷移 取處于對數生長期的細胞，0.25%胰酶消化后，用1640培養基制成單細胞懸液，計數后按照每孔5×105/個細胞均勻接種至6孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養。按照分組條件處理48h，0.25%胰酶消化收集，1 200r/m，離心3min，去上清，PBS潤洗2次，清洗掉殘余血清。無血清培養基重懸細胞，細胞計數板計數，用無血清培養基稀釋細胞濃度至2×105/mL，備用。在24孔板中加入800μL含10%胎牛血清的培養基，并放入Transwell小室，在Transwell上室分別接入200μL各組細胞懸液，37℃，5%CO2培養箱培養48h;取出Transwell用PBS清洗小室，用70%冰乙醇溶液固定細胞1h;用0.5%結晶紫染液染色，室溫中放置20min，PBS清洗后用干凈的棉球將上室一側的未遷移的細胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照，每個小室隨機選取5個視野，計數遷移的細胞。

1.2.4 Matrigel膠實驗檢測細胞管腔形成 于4℃過夜融化Matrigel膠，預冷24孔板和槍頭，每孔200μL基質膠加至24孔板，低速無菌離心除去氣泡，37℃孵育40min，取上述不同分組處理48h后的細胞，0.25%胰酶消化后，用無血清培養基制成單細胞懸液，計數后按照每孔2×105/個將細胞均勻接種至預鋪有基質膠的24孔板中，37℃、5%CO2飽和濕度條件過夜培養后在顯微鏡下拍照。隨機取3個視野(×100)照相，采用Image J圖像分析軟件計算完整管腔數(每3個分叉處記作1個血管腔)，取平均值。

統計學分析:本研究采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以均數±標準差(珋x±s)表示，組間差異采取方差分析和LSD－t檢驗進行比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

圖1 各組細胞增殖率比較 bP＜0.001 vs空白對照組;dP＜0.001 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

圖2 各組RF/6A細胞遷移情況(×200) A:空白對照組;B:甘露醇對照組;C:高糖組;D:高糖+APN組。

2 結果

2.1 APN促進高糖條件下的RF/6A細胞增殖 CCK－8實驗結果顯示，空白對照組(100.00%±0.00%)、甘露醇對照組(99.09%±0.46%)、高糖組(71.42%±2.29%)、高糖+APN組(90.87%±1.68%)細胞增殖率比較，差異具有統計學意義(F=254.16，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細胞增殖率差異無統計學意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細胞增殖無明顯影響。高糖組細胞增殖率明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，提示高糖培養條件下的細胞增殖受到明顯抑制。高糖+APN組細胞增殖率明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，而明顯高于高糖組(P＜0.001)，提示 10μg/mL APN處理后細胞增殖較高糖培養條件下有所增強，但仍然低于正常水平，見圖1。以上結果表明，高糖條件下細胞增殖低于對照組，APN對細胞增殖具有保護效應。

2.2 APN抑制高糖誘導的RF/6A細胞遷移 Transwell實驗結果顯示，空白對照組(121.60±6.02個)、甘露醇對照組(119.60±9.39個)、高糖組(144.20±9.65個)、高糖+APN組(73.00±6.04個)細胞遷移數比較，差異具有統計學意義(F=70.28，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細胞遷移數差異無統計學意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細胞遷移無明顯影響。高糖組細胞遷移數明顯高于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.001)，提示高糖培養條件下細胞遷移明顯增強。高糖+APN組細胞遷移數明顯低于空白對照組、甘露醇對照組和高糖組(均P＜0.001)，提示10μg/mL APN處理后細胞遷移較高糖培養條件下有所減弱，且低于正常水平，見圖2、3。上述結果表明，高糖條件可以明顯誘導RF/6A細胞發生遷移，而APN作用后對高糖誘導的細胞遷移具有明顯的抑制作用。

圖3 各組細胞遷移數比較 bP＜0.001 vs空白對照組;dP＜0.001 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

2.3 APN抑制高糖誘導的RF/6A細胞管腔形成Matrigel實驗結果顯示，空白對照組(12.11±0.84個)、甘露醇對照組(12.22±0.96個)、高糖組(16.00±2.90個)、高糖+APN組(7.89±0.38個)細胞管腔形成數比較，差異具有統計學意義(F=12.92，P＜0.001)?？瞻讓φ战M與甘露醇對照組細胞管腔形成數的差異無統計學意義(P＞0.05)，提示高滲透壓對細胞管腔形成無明顯影響。高糖組細胞管腔形成數明顯高于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.05)，提示高糖培養條件下細胞管腔形成明顯增強。高糖+APN組細胞管腔形成數明顯低于空白對照組和甘露醇對照組(均P＜0.05)，也明顯低于高糖組(P＜0.001)，提示10μg/mL APN處理后細胞管腔形成較高糖培養條件下有所減弱，且低于正常水平，見圖4、5。上述結果表明，高糖條件可以明顯誘導RF/6A細胞的血管形成，而APN作用后對高糖誘導的血管形成具有抑制作用。

3 討論

高血糖是DM最基本的病理生理狀態，在DM血管并發癥的發生發展中起著重要作用。高血糖導致的血管滲透性增加，炎癥和內皮細胞損傷是DR發生發展的基礎［14］。本研究提示，高糖處理48h可以明顯減少細胞增殖，導致細胞活力下降，與我們前期采用MTT實驗獲得的研究結果一致［15］。普遍認為，CCK－8檢測的重復性可能優于MTT，結果變異率小，對細胞毒性小。高糖條件下培養的RF/6A細胞遷移和管腔形成能力明顯較空白對照組及甘露醇對照組增強，提示高糖是刺激血管生成的直接因素，與文獻報道一致［15－16］。

圖4 各組RF/6A細胞管腔形成情況(×100) A:空白對照組;B:甘露醇對照組;C:高糖組;D:高糖+APN組。

圖5 各組細胞管腔形成數比較 aP＜0.05 vs空白對照組;cP＜0.05 vs甘露醇對照組;fP＜0.001 vs高糖組。

研究表明，由脂肪細胞分泌的生物活性物質與多種代謝性疾病的發生和發展密切相關，其中APN已被證明與代謝綜合征、DM及心血管疾病的發生呈負相關關系［17］。近年研究提示，APN主要作用于胰島B細胞、血管內皮細胞、肝細胞、心肌細胞、脂肪細胞、免疫細胞等靶細胞［18］，通過多種復雜信號通路發揮抗炎、抗氧化應激、改善內皮細胞功能及調節血管新生的作用，從而影響動脈粥樣硬化進展、保護血管內皮和心肌、調節微循環及血管新生［19－21］。血管新生是一個十分復雜的生物過程，涉及細胞增殖、遷移、完整的網絡狀血管形成等多個環節，各種血管生長因子和細胞因子參與其中。關于內皮細胞血管生成方面的研究提示，APN對血管新生具有雙向調節作用:(1)在組織缺血狀態下，APN可刺激血管新生，建立側枝循環，改善缺血組織的血供。DM患者常因血管內皮受損、動脈粥樣硬化而影響冠狀動脈及外周肢體的血液供應，導致冠心病和肢體壞疽的發生。對該類患者進行血管內皮祖細胞或骨髓單核細胞移植，誘導其在缺血組織中分化而促使血管重建是一種全新的治療方法［19］。關于該類細胞移植治療的研究發現，APN可促進骨髓單核細胞的存活和增殖，接受細胞移植治療者必須具有較高的血清APN水平才能有效誘導內皮祖細胞的分化，促進血管生成［22］。APN可通過激活腺苷酸活化蛋白激酶－內皮型一氧化氮合酶(AMPK－eNOS)信號通路發揮誘導人臍靜脈血管生成的作用，在小鼠基質膠塞實驗和兔角膜新生血管模型中，APN可刺激血管結構的生長［23］。此外，APN可以糾正APN基因敲除小鼠由于缺血應激誘導的血管生成受損［24］。在大腦中動脈閉塞的小鼠模型中發現，APN的過度表達明顯促進了缺血損傷小鼠大腦的局灶性血管生成［25］。與上述研究結果相似，本研究結果表明，APN可以顯著促進高糖條件下的RF/6A細胞的存活及增殖，提示APN對高糖導致的RF/6A細胞損傷起一定的保護作用。(2)APN可以抑制某些病理狀態下新生血管的生成。研究發現，APN可以通過抑制冠狀動脈內皮細胞和腫瘤細胞的遷移和增殖發揮抗血管生成效應［26－29］。缺氧導致的APN基因敲除小鼠病理性視網膜血管新生更為嚴重［10］。研究顯示，給予氧誘導的視網膜病變小鼠腹腔注射重組鼠APN蛋白，APN可以通過激活內源性eNOS促進生理性一氧化氮生成，同時又能抑制活性氧簇(ROS)/活性氮簇(RNS)的產生，在缺血性視網膜病變進程中發揮視網膜血管的保護作用［29］。本研究發現，APN可以顯著抑制高糖條件下的RF/6A細胞遷移和管腔形成，提示APN對病理刺激條件下的血管生成過程起抑制作用，與上述研究結果一致。

綜上，APN在內皮細胞的血管生成過程中扮演著不同的角色，其促進或抑制效應可能與生理或病理條件、內皮細胞類型、APN濃度等有關。本研究觀察APN對高糖條件下RF/6A細胞增殖、遷移和管腔形成的作用，結果提示APN可以抑制高糖對視網膜血管內皮細胞的損傷，并促進其修復，同時抑制病理性血管生成，但具體機制仍需進一步研究。目前，對DR尤其是PDR還缺乏完全有效的治療方法或藥物，本研究結果提示APN治療DR可能是一種嶄新的思路，進一步深入研究APN的具體作用機制和信號通路很有可為治療PDR提供新方法。