視網膜色素上皮細胞表達IL－1β和IL－6與細胞自噬的關系

羅永鋒，李 蓉，王 強，姚 楊

作者單位:1(467100)中國河南省郟縣光明眼科醫院;(710077)中國陜西省西安市，西安醫學院第一附屬醫院 2眼科;3感染控制科;4中心實驗室

0 引言

細胞自噬是一種普遍存在于真核生物中的溶酶體降解途徑，能對損傷的細胞器和毒性蛋白聚合物等細胞內產物進行包裹、消化、降解和再利用，以滿足細胞自身的代謝需要以及細胞器的更新［1－2］。自噬在衰老、腫瘤、炎癥、神經退行性疾病中起重要作用，故已成為目前生物學領域的研究熱點。炎癥反應的發生在很大程度上與細胞自噬存在密切關聯，其機制涵蓋多個方面，并且在眼科疾病中可能發揮重要作用［3］。

視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是一種具有多種復雜生理生化功能的色素細胞，分泌的多種生長因子可影響神經視網膜細胞及其自身的生理特性，也與眼部疾病的發生密切相關［4］。在正常生理條件下，炎性細胞因子主要由單核巨噬細胞產生，病理條件下神經膠質細胞、RPE細胞等也可分泌［5］。炎性因子 IL－1β和 IL－6具有多種生物功能活性，與機體免疫、各種器官的生理功能有關，目前對于RPE細胞表達IL－1β和IL－6與細胞自噬的關系尚不清楚。LC3、Beclin－1和p62等是參與自噬體或自噬溶酶體形成的關鍵蛋白，近年來作為自噬標記物被廣泛用于相關研究中［6－7］。3－甲基腺嘌呤(3－MA)和氯喹(CQ)是兩種應用廣泛的自噬抑制劑，分別作用于自噬的早期和晚期階段?；诖?，本研究觀察細胞自噬在缺氧條件下RPE細胞表達IL－1β和IL－6中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 ARPE－19細胞系(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM/F12培養基(美國Gibco公司);3－MA(美國Selleck公司);CQ(美國Sigma公司);兔抗人LC3B多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人Beclin－1多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人p62多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人GAPDH多克隆抗體(杭州賢至生物有限公司);HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);人IL－1β和IL－6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。三氣培養箱(上海力申科學儀器有限公司，HF－100型);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，IX51型);全自動酶標儀(美國Thermo scientific公司，Multiskan MK3型)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 用不含EDTA的0.25%胰酶消化ARPE－19細胞，用含10%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養基終止消化，輕輕吹打混勻成單細胞懸液，傳代至培養皿中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。取對數生長期、生長狀態良好的細胞(5～10代)接種于6孔板，每孔5×105個細胞。待細胞貼壁后將細胞分為缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組、正常對照組，其中缺氧組細胞置于 O2∶CO2∶N2體積比為 1∶5∶94 的培養箱中培養24h;3－MA+缺氧組細胞先用10mmol/L 3－MA預處理2h，然后處理方法同缺氧組;CQ+缺氧組細胞先用50μmol/L CQ預處理2h，然后處理方法同缺氧組。對照組細胞在正常氧條件下培養。

1.2.2 ELISA 所有分組的細胞因子均采用酶聯免疫吸附劑測定分析方法(ELISA)進行檢測，具體參照說明書進行操作。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕藴势泛蜆悠废♂屢?00μL，余孔分別加標準品或待測樣品100μL。酶標板覆膜，36℃孵育90min。充分洗板后空白孔加入生物素化抗體稀釋液，其余孔中加入生物素化抗體工作液100μL，覆膜后36℃溫育1h。充分洗板后向空白孔加入酶結合稀釋液，其余孔加酶結合物工作液100μL，覆膜后36℃溫育30min。洗板后每孔加顯色劑(TMB)100μL，酶標板加上覆膜在37℃避光孵育15min，每孔加終止液100μL，終止反應，用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.3 Western blot 細胞處理完成之后，棄培養液，預冷PBS漂洗3次，加400μL含PMSF的裂解液使細胞充分裂解，離心提取細胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。30%丙烯酰胺SDS－PAGE凝膠電泳后將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液常溫封閉2h;一抗孵育:將膜分別放入稀釋好的抗體 LC3B(1∶1000)、Beclin－1(1∶1000)、p62(1∶1000)及 GADPH(1∶1000)中，4℃搖床過夜。用TBST洗膜3次，每次10min;二抗孵育:將膜放入用稀釋液稀釋好的HRP標記的二抗(1∶50000)中避光常溫孵育1～2h。用TBST洗膜3次，每次10min;ECL顯色曝光，掃描膠片后使用BandScan系統軟件分析蛋白條帶。將目的蛋白LC3B、Beclin－1和p62與內參GAPDH灰度的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗均在不同時間3次生物學重復。

統計學分析:采用統計軟件SPSS20.0對數據進行處理及分析，計量資料以均數±標準差(珋x±s)表示，計量資料均符合正態分布，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ARPE－19細胞形態 培養24h在倒置顯微鏡下觀察，ARPE－19細胞形態呈現扁圓形、梭形、多角形或者不規則形，貼壁良好，胞漿內未見明顯黑色素顆粒。不同組之間的細胞形態未見明顯差異，見圖1。

2.2 各組RPE細胞表達IL－1β及IL－6的濃度比較 IL－1β和IL－6濃度的標準曲線(圖2)及相應的濃度方程為:y=(－0.2463+311.0454x)/(1+0.1937x－0.1366x2)，y=(0.9089+117.3496x)/(1－0.4715x+0.0727x2)，獲得各組細胞上清液中IL－1β和IL－6的濃度。ELISA結果顯示培養的細胞在未受到刺激的情況下僅僅產生少量的IL－1β和IL－6。缺氧刺激之后，上清液中IL－1β和IL－6的產量迅速增加，3－MA或CQ可以明顯抑制IL－1β和IL－6的產生(圖3)。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細胞的 IL－1β 濃度分別為 195.01±5.62、167.80±3.15、131.78±5.38、98.37±5.49pg/mL，總體比較差異有統計學意義(F=211.89，P＜0.01)。兩兩比較發現，缺氧組的IL－1β濃度明顯高于對照組、3－MA+缺氧組和 CQ+缺氧組，差異均有統計學意義(P＜0.01)。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細胞的IL－6濃度分別為252.32±12.48、165.45±10.13、90.07±5.37 和 53.13±2.60pg/mL，總體比較差異有統計學意義(F=317.15，P＜0.01)。兩兩比較發現，缺氧組的IL－6濃度明顯高于對照組、3－MA+缺氧組和CQ+缺氧組，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見圖3。

圖1 倒置顯微鏡下觀察ARPE－19細胞形態(×100) A:對照組;B:缺氧組;C:3－MA+缺氧組;D:CQ+缺氧組。

圖2 IL－1β及 IL－6的濃度標準曲線 A:IL－1β;B:IL－6。

圖3 ELISA檢測 IL－1β及IL－6濃度的統計柱狀圖 A:IL－1β;B:IL－6。bP＜0.01 vs缺氧組。

圖4 Western blot檢測各組細胞LC3B、Beclin－1和 p62的蛋白條帶圖。

2.3 各組RPE細胞自噬水平的比較 Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，缺氧組細胞自噬激活，表現為LC3B－Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin－1這兩種蛋白條帶增強和 p62蛋條帶減弱。與缺氧組比較，當采用自噬抑制劑3－MA預處理細胞，LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表達則明顯降低，p62的表達明顯升高;采用自噬抑制劑 CQ預處理細胞，Beclin－1的表達明顯降低，LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表達明顯升高，見圖4。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細胞中的LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1及p62的相對蛋白表達量分別為(0.50±0.05、0.34±0.01、0.67±0.05 和 0.24±0.02)、(0.97±0.05、0.78±0.06、0.54±0.01 和 0.32±0.03)和(0.32±0.10、0.78±0.08、0.96±0.02 和 1.03±0.02)。組間總體比較差異均有統計學意義(LC3B－Ⅱ/Ⅰ:F=80.65，P＜0.01;Beclin－1:F=139.29，P＜0.01;p62:F=70.64，P＜0.01)。之后兩兩比較發現，缺氧組細胞中LC3B－Ⅱ/Ⅰ和Beclin－1的相對蛋白表達量均明顯高于對照組和3－MA+缺氧組，缺氧組中LC3B－Ⅱ/Ⅰ的相對蛋白表達量低于CQ+缺氧組，差異均有統計學意義(P＜0.01)。缺氧組細胞中p62相對蛋白表達量明顯低于對照組、3－MA+缺氧組和CQ+缺氧組，差異均有統計學意義(P＜0.01)，見圖5。

3 討論

RPE細胞是一種具有多種復雜生理生化功能的色素細胞，在眼的發育和視覺功能中起著非常重要的作用［8］。在疾病狀態下，視網膜細胞的結構和功能會發生改變，其中RPE細胞是病變的中心環節，其結構或功能異常會導致視網膜感光細胞功能受損、視網膜退化等疾病的發生。研究證實，RPE細胞是參與增生性玻璃體視網膜病變、年齡相關性黃斑變性及糖尿病視網膜病變等的主要細胞，它分泌的IL－1β、IL－6等炎性因子在趨化細胞移動、啟動細胞增生、分泌膠原和纖維血管膜形成中可能發揮重要作用［9－12］。RPE 受刺激后能分泌 IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、干擾素－γ和單核細胞趨化蛋白－1等多種炎性細胞因子［13］。上述眼底疾病的發生與缺氧、慢性炎癥密切相關。本研究以ARPE－19細胞(廣泛用于眼底疾病研究的一種細胞模型)為研究對象，也發現在缺氧刺激條件下，RPE細胞分泌IL－1β、IL－6的水平升高，與上述文獻報道的結果相符。

圖5 各組細胞LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1和p62蛋白相對表達量的統計柱狀圖 A:LC3B－Ⅱ/Ⅰ蛋白;B:Beclin－1蛋白;C:p62蛋白。bP＜0.01 vs缺氧組。

作為普遍存在于真核生物細胞內的一種機制，細胞自噬能對內環境穩定進行自我維持，且在生長、發育等多種生理活動中發揮重要作用，多種代謝應激可誘導自噬激活［1］。作為自噬標記蛋白，LC3、Beclin－1 和 p62 等被廣泛用于自噬的研究中。LC3是自噬相關蛋白ATG8在哺乳動物的類似物，參與前體膜的延長和閉合，也參與自噬體的形成，故ATG8/LC3是自噬的重要分子標記物［14］。LC3在其C末端被ATG4剪切，形成LC3－Ⅰ。LC3－Ⅰ通過ATG7和ATG3與磷脂酰乙醇胺相結合形成酯化產物LC3－Ⅱ，特異性結合于自噬體膜上。LC3－Ⅱ始終穩定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合。Beclin－1是自噬相關蛋白ATG6在哺乳動物的類似物，是其他自噬蛋白基因參與自噬形成過程的必須成分［15］，當自噬被抑制時，Beclin－1的表達降低。p62/SQSTM1蛋白是一種同LC3相互作用的蛋白，對降解底物的識別和包裹起著關鍵作用，p62的蛋白表達越低，說明底物降解越少，則自噬活性越強，即p62的水平與自噬活性呈負相關［16］。由于LC3抗體對LC3－Ⅱ具有更高的親和力，會造成假陽性結果，因此判斷自噬活性的強弱還需同時考慮溶酶體活性的影響。在研究中需要結合LC3－Ⅱ及p62的蛋白表達綜合判斷自噬活性的強弱。本研究發現在缺氧條件下，RPE細胞的LC3B－Ⅱ/Ⅰ(LC3B是LC3的主要亞型)、Beclin－1蛋白表達增加及p62蛋白表達下降，證實缺氧誘導了RPE細胞的自噬激活。

眾所周知，視網膜對缺氧及繼發的氧化應激高度敏感，故各種缺血性視網膜疾病，如糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞等都與缺氧密切相關。因此，本研究將缺氧作為刺激條件，觀察RPE細胞功能與其自噬水平的關系。鑒于不同自噬抑制劑的作用機制存在差異，在本研究中我們采用了兩種自噬抑制劑對RPE細胞進行了干預，以避免使用某一種抑制劑可能帶來的結果偏差。其中，3－MA是一種應用廣泛的自噬抑制劑，它作用于自噬誘導階段，特異性阻斷自噬體的形成［17］，故作用后 LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表達降低，p62的表達升高(不能被降解);CQ是一種溶酶體自噬抑制劑，可以阻止晚期階段自噬體與溶酶體的結合，抑制自噬的降解，使得自噬體在細胞內增加，作用后會使LC3－Ⅰ向LC3－Ⅱ的轉換增加更為明顯［18］，故作用后LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表達升高，而Beclin－1的表達降低(自噬過程被抑制)。10mmol/L是用3－MA處理ARPE－19 細胞的常用濃度［19－20］，故本研究也采用了這一濃度。此外，有研究發現，10～30μg/mL CQ不會影響細胞活力和代謝，且10～20μg/mL的濃度對細胞活力的影響無明顯差異［21］。另一研究提示，10μmol/L CQ 作用于ARPE－19細胞24h不會導致細胞死亡，而在250μmol/L時幾乎100%的細胞死亡，預測LD50介于100～120μmol/L之間［22］。因此，本研究選擇 50μmol/L(即 16μg/mL)濃度的CQ來抑制自噬也是合理的。本研究發現缺氧刺激可促進RPE細胞表達IL－1β、IL－6，3－MA或 CQ處理后減少了二者的表達。3－MA和CQ預處理得到的結果一致，證明抑制自噬能減少RPE細胞表達IL－1β和IL－6。

IL－1β是IL－1家族成員之一，是細胞間信號傳遞的基本的介質，具有多種生物功能活性，例如促進成纖維細胞增生、透明質酸酶和前膠原的合成等［5，23］。IL－6是一種單鏈糖蛋白，是與機體免疫、各種器官生理功能有關的多向性細胞因子，調節細胞生長、分化、凋亡、轉化及免疫反應［24－25］。目前，越來越多的研究認為自噬與機體免疫和炎癥有著密切的關系，但在眼科的相關研究較少［3，26］。因此，本研究觀察了不同刺激條件下RPE細胞分泌IL－1β和IL－6的情況及其與細胞自噬的聯系。結果表明，在缺氧刺激條件下 RPE細胞自噬激活，表現為LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1 表達增強，p62 表達減弱，同時細胞分泌IL－1β和IL－6的水平升高，且采用自噬抑制劑3－MA和 CQ能夠減少 IL－1β和 IL－6的表達。鑒于IL－1β和 IL－6在纖維增生等病理過程中起重要作用［27－28］，我們推測缺氧誘導自噬激活并促進 RPE細胞分泌IL－1β和IL－6，可能是這些炎性因子參與多種眼底疾病病理過程的重要機制。不過，自噬對RPE細胞分泌IL－1β和IL－6的具體調控機制，以及對纖維增生性眼病的確切影響還需進一步研究。