嘉定白蒜脫毒微鱗莖誘導的快繁技術研究

高 暢楊 飛沈若剛趙穎雷李 賢郟惠彪

（1上海蔬菜研究所，上海 201899；2上海交通大學農業與生物學院，上海200240；3上海市農業科學院園藝研究所，上海 201403；4上?；莺头N業有限公司，上海 201899）

嘉定白蒜聞名遐邇，以其色澤白、蒜頭肥大、肉質脆嫩、辛辣味濃、耐貯藏等獨有特點，曾是我國大蒜出口歷史長、出口量大的重要品種之一，為上海嘉定當地農民的增產創收發揮了重要作用。大蒜（Allium sativum L.）生產主要用鱗莖作為繁殖材料，繁殖系數低，而且繁殖器官也是產品器官，栽培成本高。同時，大蒜無性繁殖存在病毒感染和積累的問題。病毒在植物體內爭奪核酸和蛋白質等營養，產生對植物有害的毒素，受病毒影響的大蒜生長發育受阻，種質退化嚴重，導致大蒜生產上出現歉收甚至絕收（周桂珍和曹鳴慶，1989；徐培文和楊崇良，2000；張威 等，2008）。受多種因素的制約，近30 a來嘉定白蒜的種植和出口每況愈下。傳統的留種方式已不足以抵御病毒病危害，難以再持續發揮嘉定白蒜的品種優勢，采用現代生物技術恢復和改良嘉定白蒜的種性已刻不容緩（周緒元 等，2003；李皓和陳嘉瑞，2006）。

本試驗以嘉定白蒜為試材，研究了組培莖尖脫毒技術、誘導組培微鱗莖技術，旨在從根本上解決田間蒜瓣無性繁殖感染病毒后引起的種質退化問題。以組培誘導形成微鱗莖的工廠化快繁方式，革新了普通大蒜組培苗出苗方式，有效降低了組培苗馴化成本，促進了組培脫毒微鱗莖至脫毒種蒜培育的長周期產業鏈發展，可有效地挽救和傳承嘉定白蒜地理標志聲譽，恢復嘉定白蒜的國際市場競爭力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試嘉定白蒜取自上海市嘉定區，2016年9月種植于上?；莺头N業有限公司嘉定白蒜種蒜繁殖基地（上海市嘉定區滬宜公路5062號）。2017年5月由上海蔬菜研究所專業人員，對采收的嘉定白蒜蒜頭進行種源鑒定；然后選取蒜瓣7～8瓣，蒜瓣高度3～4 cm，單瓣質量6～8 g，色澤白、蒜頭肥大、肉質脆嫩、辛辣味濃的具有嘉定白蒜典型特征的蒜頭作為外植體供試材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體脫毒莖尖獲取方式與無菌苗培養基設計 莖尖脫毒方式：取大蒜鱗瓣，剝去大蒜皮，用自來水沖洗干凈，再用75%酒精消毒60 s，倒出酒精后用無菌水沖洗2次，然后再用20%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，最后用無菌水沖洗5次（海燕 等，2010）。剝取切割獲得蒜心中部的蒜芽，高度1.0～2.0 cm（帶底部基盤），再將蒜芽外層包裹的葉片在40倍解剖鏡下剝除，最后獲取3種莖尖等級，分別是完全不帶葉原基包裹的純芽原基生長點、帶1個葉原基包裹的芽原基生長點，以及帶2個葉原基包裹的芽原基生長點，依次記為莖尖1、莖尖2和莖尖3。對照（CK）為不剝取莖尖脫毒、高度1.0 cm的蒜芽，記為莖尖4。

無菌苗培養基設計：莖尖接種啟動培養基的基礎培養基為MS，pH為5.8，蔗糖30 g·L-1，瓊脂6.0 g·L-1。培養基中添加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）與 NAA（0.1、0.2、0.4 mg·L-1）（林碧英和傅睿清，2008；劉苗苗 等，2017）。

以不同莖尖脫毒方式、不同6-BA與NAA濃度作為影響因素，套用三因素三水平正交試驗表設計試驗，試驗處理編號與因素水平組合見表1。

接種及培養方法：每個編號的處理包含10個樣本，5次重復，10個處理共接種莖尖500個。接種材料經暗培養5～7 d后轉光培養，培養溫度23～25 ℃，光照強度1 000～2 000 lx，光照時間14～16 h·d-1（馮纓 等，1993；湯青林 等，2006）。外植體接入培養基培養7 d后查除污染，無污染莖尖經過30 d培養后統計無菌苗成活率。

1.2.2 潛伏芽激活與增殖培養基的設計 外植體在啟動培養基上形成無菌苗后，采用3種切割方式激活潛伏芽：① 切除部分頂葉，取單株高3.0 cm；②將單株假莖去頂，取單株高1.5 cm；③ 將單株假莖去頂，取單株高1.0 cm，再沿中軸線對半縱切假莖；分別記為切割1、切割2、切割3；對照（CK）：高5 cm的單株，保留單株頂部，記為切割4（圖1）（王云云 等，2013）。

圖1 潛伏芽激活切割方式

增殖培養基設計：基礎培養基采用MS培養基，pH為5.8，蔗糖30 g·L-1，瓊脂6.0 g·L-1，培養基中添加不同濃度6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）與 NAA（0.05、0.10、0.20 mg·L-1）（張素芝和李紀蓉，2006a；孔素萍 等，2010）。

以不同潛伏芽激活切割方式、不同6-BA與NAA濃度作為影響因素，套用三因素三水平正交試驗表設計試驗，試驗處理編號與因素水平組合見表2。

接種及培養方式：每處理接種30株，5次重復，10個處理共接種試管苗1 500株。培養溫度 23～25 ℃，光照強度 2 000～3 000 lx，濕度50%～60%，光照時間14～16 h·d-1，培養28 d后統計無菌苗腋葉間潛伏芽的增殖倍數（董瑞 等，2013）。

1.2.3 莖尖脫毒效果的PCR分子檢測 將1.2.2中獲得的單株系增殖材料，根據1.2.1脫毒莖尖獲取方法的不同，利用PCR技術進行大蒜組培莖尖脫毒效果檢測（張威 等，2008）。

試驗方法1：根據1.2.1中3種脫毒莖尖獲取方法，各取2個株系產生的嘉定白蒜莖尖試管苗，分別記為莖尖1、莖尖2、莖尖3，送樣至上海農業科學院進行PCR分子水平的病毒檢測。按照反轉錄試劑盒的要求抽提RNA，并合成cDNA，作為PCR擴增的模板，按照大蒜普通潛隱病毒（GCLV）中間保守序列設計1對引物（R44366=GCLV：5′-GTGGTTTGGAATGAA-3′；R44367=GCLVF：5′-CG ATCCATTGAAGTTTGT-3′），以反轉錄合成的大蒜cDNA（S1，S2）第一鏈為模板進行PCR擴增。擴增條件為：94 ℃預熱10 min；94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃3 min，共35個循環。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片斷（徐培文和楊崇良，2000）。

試驗方法2：單獨檢測以莖尖2方式獲取的株系，取10個株系，重復試驗方法1中的PCR分子檢測程序。

1.2.4 組培微鱗莖誘導材料莖粗與不同培養基配方的設計 將1.2.3中病毒檢測合格的株系增殖形成的芽團，株高要求3～4 cm，按不同莖粗分成不同等級。以不同莖粗（1、2、3 mm），不同NAA（0.1、0.2、0.4 mg·L-1）與糖（30、60、90 g·L-1）濃度，及不同pH（5.8、6.3、7.0）作為影響因素，套用四因素三水平正交試驗表設計試驗，試驗處理編號與因素水平組合見表3（張素芝和李紀蓉，2006b）。

將不同莖粗的單株切除基部枯萎黃化老葉后接種，每處理50株，5次重復。培養溫度16～22℃，光照強度800～1 000 lx，濕度50%～60%，培養14、35、50 d后測定微鱗莖誘導率（趙彥杰，2006）。

1.2.5 數據處理 使用SPSS Statistics 23軟件對試驗數據進行統計分析。采用單因素ANOVA進行多重比較，采用Duncan進行差異顯著性分析（P＜ 0.05）。

2 結果與分析

2.1 最適莖尖脫毒方式與無菌苗培養基的篩選

由表1可以看出，極差分析結果RA＞RB＞RC，即各因素對無菌苗成苗率的影響程度為6-BA＞NAA＞莖尖脫毒方式，其中6-BA（P=9.32×10-10）與 NAA（P=1.0×10-6）對成苗率的影響達極顯著水平；正交優化最佳培養條件為A2B1C2，即本試驗處理4，當培養基中6-BA為1.0 mg·L-1、NAA為0.1 mg·L-1、采用莖尖2時無菌苗成苗率最高，達76%。從無菌苗生長狀態來看，處理4無菌苗的頂芽伸展正常、高度2.5～3.5 cm，葉色嫩綠，無菌苗建立效果最好（圖2-a、2-b、2-c）。在較高的6-BA水平下，無菌苗容易出現玻璃化現象，頂芽肥厚且扭曲，在NAA 濃度同時升高時（處理9）出現膨大透明的愈傷組織，且無菌苗高度1.5～3.5 cm，呈水漬狀透明，玻璃化嚴重，活性差。低激素水平則無菌苗生長速度緩慢，對照培養基激素為0，未脫毒單芽深綠瘦弱，生長緩慢，無菌苗高度0.5～1.0 cm。

表1 不同莖尖獲取方法在不同培養基上嘉定白蒜的無菌苗成苗率

2.2 潛伏芽激活與增殖培養基的篩選

極差分析結果顯示（表2），RA＞RB＞RC，說明各因素對增殖倍數的影響程度為6-BA＞NAA＞切 割 方 式，6-BA（P=5.25×10-26）、NAA（P=5.90×10-16） 與 切 割 方 式（P=7.59×10-19）對增殖倍數的影響極顯著；正交優化最佳條件為A2B2C3（本試驗處理5），即當培養基中6-BA為1.0 mg·L-1、NAA為0.10 mg·L-1、采用切割方式3時潛伏芽增殖倍數最高，達3.22，顯著高于其他處理。采用切割3方法進行潛伏芽激活，徹底破壞了大蒜的生長點，增殖芽生長勢良好，株高6～8 cm，莖粗1.5～2.0 mm（圖2-d）；切割1和切割2的方法均未有效破除生長點優勢，無論激素水平如何，只保留原始單株生長，無明顯增殖或較少增殖。

圖2 嘉定白蒜脫毒無菌苗的建立

表2 不同潛伏芽激活切割方式與培養基配方組合處理下嘉定白蒜的增殖倍數

2.3 莖尖脫毒效果檢測

通過3種莖尖脫毒方式獲得的6個株系，病毒檢測結果如圖3所示，莖尖3出現與對照一樣300 bp的條帶，表明攜帶大蒜潛隱病毒（GCLV），其余株系均未檢測出條帶，表明不攜帶GCLV，說明莖尖1、莖尖2兩種莖尖脫毒方式比較成功。

考慮莖尖2較莖尖1的獲取方式難度小、成苗快、成本低，有利于進行后續規?；a，因此抽樣選取10個莖尖2方式獲得的株系進行病毒檢測，結果表明全部株系莖尖脫毒成功（圖4）。

2.4 微鱗莖誘導與培養基配方選擇

圖3 3種莖尖脫毒方式的大蒜脫毒檢測結果

圖4 莖尖2脫毒方式的大蒜脫毒重復檢測結果

由極差分析可知（表3），RD＞RC＞RA＞RB，表明糖對微鱗莖誘導率的影響最大，其次為莖粗、NAA、pH，據差異顯著性分析，糖（P=4.78×10-19）、 莖 粗（P=5.80×10-13）、NAA（P=1.33×10-11）、pH（P=6.00×10-6）對微鱗莖誘導率的影響達到極顯著水平。正交優化最佳條件為A1B3C3D3，即本試驗處理3，誘導因子為NAA 0.1 mg·L-1、pH為7.0、莖粗3 mm、糖 90 g·L-1時微鱗莖誘導狀態最佳，誘導率達94.8%。據觀察（圖5），處理3培養14 d，莖基部開始膨大，外觀可見直徑0.3～0.5 cm 的微鱗莖，根原基形成；培養35 d，植株葉片部分開始枯萎，營養向基部輸送，微鱗莖膨大至0.6～0.8 cm，內部清晰可見葉片組織，生根3～5條，根長2～4 cm；培養50 d，植株葉片完全枯萎，鱗莖內部葉片組織消失，微鱗莖生長圓實，直徑0.8～1.0 cm，形成肉質大蒜，根長4～6 cm。

表3 不同莖粗等級與培養基配方對嘉定白蒜微鱗莖形成數量及大小的影響

圖5 嘉定白蒜組培微鱗莖的誘導

3 結論與討論

本試驗通過4個階段一系列的試驗，建立起一套完整的、行之有效的嘉定白蒜脫毒微鱗莖誘導的快繁技術，為組培脫毒微鱗莖工廠化培育至田間脫毒種蒜的應用，提供了科技支撐。

第一階段，大蒜莖尖剝離方式是莖尖脫毒的技術關鍵。采用3種莖尖脫毒方式及不同培養基培養，以正交試驗設計，研究最適的脫毒莖尖獲取方式，獲得活性最好的無菌苗體系，莖尖1是無葉原基包裹的莖尖生長點，在操作過程中難度大、效率低，且培養易死亡；而包裹有2個葉原基的生長點（莖尖3），又容易在切割過程中加大帶毒可能，造成脫毒失敗。處理4：MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+莖尖2，可以得到成苗率76%、頂芽伸展正常、葉色嫩綠的無菌組培苗，為組培脫毒大蒜通往產業化發展建立了有效技術途徑。

第二階段，嘉定白蒜組培快繁增殖階段，無菌苗潛伏芽的不同切割方式與培養基配方的優化是技術關鍵。大蒜組培的增殖系數較低，是因其保留了田間的生長特性，一個生長點只生長一株大蒜。本試驗通過對無菌苗單株進行不同方式的切割，結合不同增殖培養基配方，進行正交試驗設計。結果顯示：采用切割方式3，縱切中軸，完全破壞大蒜唯一的莖尖生長點，是有效激活潛伏芽的切割方式（Mathew et al.，2011），結合增殖培養基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1，增殖倍數達 3.22，增殖芽生長勢良好，株高6～8 cm，莖粗1.5～2.0 mm，可以滿足組培規?；a增殖技術需求。

第三階段，結合第一階段和第二階段，在批量生產前需要對脫毒效果進行檢測。采用PCR分子檢測技術（Son et al.，2012），提取已經增殖的脫毒株系DNA進行病毒檢測。結果表明，含1個葉原基包裹的芽原基生長點（莖尖2）脫毒率可以達到100%。采用此種脫毒方式，在組培規?；a上成效性最好，可以大大縮短無菌脫毒苗建立的時間成本、有效降低生產成本。

第四階段，假莖莖粗3 mm的組培苗單株，在MS+NAA 0.1 mg·L-1+糖90 g·L-1、pH為7.0的培養基中微鱗莖誘導率最高，達94.8%，是整體研究內容的創新之處所在。嘉定白蒜組培微鱗莖的誘導，以微鱗莖球的形式代替以往組培苗出苗的形式，可有效提高組培脫毒材料從組培恒溫、恒濕、無菌等一系列的優越條件下，過渡到普通大棚穴盤育苗環境下的煉苗、馴化成活率（Nagasawa &Finer，1988）。項目后續有必要進一步開展的研究工作：組培脫毒微鱗莖從組培室至育苗溫室第1代的原原種培育、溫室大棚原原種播種至第2代的原種隔離培育、田間原種播種至生產良種第3代的快速加倍培育等關鍵技術。研究組培脫毒大蒜與普通田間生產大蒜之間的肥水管理技術、抗逆性差異、國際貿易出口標準品占比率等各項指標的提升與變化情況。希望嘉定白蒜組培脫毒技術的生產應用，能逐步影響全國范圍的大蒜脫毒產業科技發展，實現科技創新技術服務農業產業化發展，提升產品核心競爭力，最終讓農民受益。