同工酶檢測方法及其研究進展

楊光瑞，洪 霞，何海寧，安小蘋，安 娜，袁順捷，金 瑩，楊菊梅

(1.甘肅省商業科技研究所，甘肅蘭州 730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州 730010；3.蘭州大學第二醫院，甘肅蘭州 730000)

同工酶是在長期的生物進化中，生物體為適應環境而形成的由不同基因或等位基因編碼的一類能夠催化相同化學反應、結構不同的蛋白質[1]。自1959年Marker等[2]提出同工酶概念以來，同工酶分析技術發展已接近60年了。迄今為止，已發現并研究的同工酶多達幾百種，經常運用的同工酶有肌酸激酶同工酶、過氧化物同工酶、酯酶同工酶、超氧化物氣化歧化酶、脫氫酶同工酶、過氧化氫酶同工酶等[3-5]。隨著生物技術和分子生物學的快速發展，同工酶分析技術在動物、植物、微生物、農業和醫學等方面都取得了十分顯著的成果，如利用肌酸激酶同工酶作為生物標記物進行疾病的臨床診斷、過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶物種遺傳多樣性分析和種質鑒別等[3-6]。此外，同工酶檢測技術為分析生物繁殖、體細胞雜交、染色體倍性、基因分化和表達、生物多樣性保護等提供了一個新的途徑[7-9]，具有非常廣闊的應用前景。筆者對近年來同工酶檢測技術的發展和同工酶在動植物種質資源鑒定、疾病的臨床診斷等主要應用領域的現狀進行了總結，并對同工酶檢測今后的發展前景進行了展望，以期為同工酶檢測在更多領域中的應用和進一步發展提供理論依據。

1 同工酶的檢測方法

1.1瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳進行同工酶的分析，主要是利用瓊脂糖的分子篩作用，在電場力的作用下將分子量大小不同的同工酶分子進行分離[10]。該方法與聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)相比，凝膠制備過程簡單，電泳時間短，能夠篩選出不同活性的酶，但其不論是分辨率還是分離效果均不如PAGE凝膠[11]。黃孝湘等[12]利用瓊脂糖凝膠電泳方法分析了孝感市池塘靜水和橋下流水中生活的克氏原螯蝦主要組織的LDH 同工酶譜，結果表明，克氏原鰲蝦不同組織中LDH同工酶譜存在差異；進一步根據同工酶條帶染色深淺，判斷出流水中克氏原螯蝦組織的LDH同工酶活性強于靜水。

1.2非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)檢測Native-PAGE電泳也叫活性電泳，該電泳體系中不添加十二烷基磺酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇，將有活性的同工酶蛋白直接進行電泳[13]。利用凝膠的分子篩效應和蛋白的電荷效應進行分離，在電泳過程中并不破壞蛋白質的天然構象及其亞基間的相互作用。因此，在電泳結束后，蛋白仍能保持其活性[13-14]。在電泳結束后，將凝膠塊在適宜的條件下與特異性底物進行顯色反應，便可在凝膠中觀察到同工酶特異性條帶。該方法是目前同工酶分離提純和檢測的常用方法，其優點在于分離到有活性同工酶蛋白仍具有活性，得到的同工酶譜帶具有很強的專一性，結果易于觀察[15]。但由于同工酶在凝膠中的遷移率與其分子量和所帶電荷呈正相關，在電泳過程中很可能由分子量所導致的遷移率被電荷導致的遷移率所補償，造成結果不準確。此外，Native-PAGE電泳過程必須在低溫下進行，以確保酶活性。尹明華等[16]運用該方法對江西鉛山紅芽芋低溫療法脫毒苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)同工酶譜進行測定，發現在脫毒苗中得到的同工酶譜帶與大田苗譜帶一致，證明了紅芽芋低溫療法脫毒苗具有很高的遺傳穩定性，無遺傳變異。

1.3變性-復性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測SDS-PAGE電泳的變性過程是利用SDS與同工酶多肽分子結合而實現的[15]。SDS分子攜帶大量的負電荷，當其結合在同工酶多肽分子中時，掩蔽了同工酶分子本身所攜帶的電荷，消除了電荷對同工酶電泳遷移率的影響[12]，再利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩作用，將分子質量有差異的同工酶分離。但由于SDS是一種可逆的變性劑，由它所導致的變性，在電泳完畢后加入TritonX-100除去SDS，變性的同工酶便可重新恢復活性，再與相應的底物進行染色反應，便可達到檢測目的[15]。該方法的優點在于SDS的引入消除了同工酶本身所攜帶的電荷對電泳遷移率的影響，電泳過程無需在低溫下進行。缺點在于在電泳完畢后要對蛋白質進行復性，操作比較繁瑣。該方法仍是目前同工酶檢測最常用的方法之一[12，15]。廖海等[17]利用該方法對5種菖蒲屬植物中過氧化物酶(POD)同工酶進行分離，結果發現，利用該方法得到了含有6條POD同工酶帶，而傳統的分析方法只得到了5條POD同工酶帶。

1.4雙向凝膠電泳檢測雙向凝膠電泳是利用蛋白質的等電點和相對分子量的差異進行分離，具體的操作方法是將同工酶樣品根據等電點大小進行第1向分離；再將已完成第1向分離的酶分子以垂直于第1向的方向按照分子量大小進行第2向電泳，得到雙向分離的同工酶圖譜[13]。該方法的優點在于其分辨率和分離效果優于其他任何單向電泳，缺點在于所分離同工酶常常容易失活，尤其不適用于堿性同工酶的分析[18-19]。張少麗等[19]利用雙向凝膠電泳對大白菜溫敏雄性不育系TsCMS7311(A)及其保持系7311(B)的小花蕾的β-酯酶同工酶帶區進行分析，結果發現，保持系B和轉化后的不育系AT在經過第1向電泳后均具有2條特異性β-酯酶同工酶譜帶，而在經過第2向電泳后各得到了6個β-酯酶同工酶特異性條帶。

2 同工酶分析技術的應用

2.1同工酶在植物水平遺傳多樣性分析中的應用同工酶作為基因表達的直接產物，其差異性反映了基因表達的差異性，因此對生物體同工酶譜的分析可間接獲得基因層面的差異[7，9]。同工酶除了具有物種和組織特異性外還具有高度保守性，同一物種的相同組織中同工酶譜具有很高的相似度，是研究種間和種內遺傳多樣性的重要手段[20-21]。過氧化物酶(POD)同工酶廣泛存在于植物組織中，具有很強的氧化還原活性，參與植物體內許多催化反應。在不同植物和同一植物不同的生長階段POD同工酶的活性和數目差異很大，因此它能夠很大程度上反映植物生長、代謝特點、品種之間的遺傳差異。同時，POD同工酶圖譜在一定條件下較為穩定，具有種屬特異性，是一種良好遺傳標記物，目前已被廣泛應用于植物種質鑒定、遺傳多樣性分析[22-24]。馬永平等[25]對寧夏枸杞和黑果枸杞中過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)及超氧化物歧化酶(SOD)同工酶酶譜進行分析，結果發現在這2種枸杞中，EST和SOD同工酶酶譜所包含的遺傳信息有限，而POD同工酶酶譜所攜帶的遺傳信息豐富且差異顯著，因而POD可作為枸杞同工酶遺傳多樣性分子標記。李淑娟等[26]對三江源自然保護區的6個野生種10個居群的鵝觀草屬進行POD同工酶譜帶特征分析，結果表明，三江源地區鵝觀草屬植物遺傳多樣性豐富，不同種間POD 同工酶酶譜特征及相似程度上均有一定差異，同一物種的不同居群間酶譜既具有較穩定的相似性，又具有細微差異。

除POD外，目前已有多種同工酶已作為分子標記用于評價植物遺傳變異性、親緣關系和種系發生等方面，并取得了很好的效果[21]。肖慧等[27]對文山三七等5種三七的POD、EST和乳酸脫氫酶(LDH)等6種同工酶譜進行分析，根據同工酶酶譜所得的遺傳距離結果，發現黃果三七、紫果三七和廣西三七的遺傳關系較近，而文山與廣西三七的遺傳關系相對較遠。

同工酶氨基酸序列受基因控制，而表達結果受遺傳和環境的雙重影響，其氨基酸分子改變，導致蛋白組結構、帶電荷量、電泳遷移率改變，因而使其在揭示群體之間和群體內的遺傳變異、親緣關系等方面具有顯著的優勢。此外還可通過共顯性同工酶數據中每個位點的等位基因的有效數量、雜合性和多態性對植物遺傳變異進行評估。El-Esawi等[28]利用酸性磷酸酶(ACP)、過氧化氫酶(CAT)及EST同工酶酶譜研究了萵苣的遺傳變異、種群結構和親緣關系，結果表明，同工酶系統共顯示16個位點，共31個等位基因；在這16個位點中，11個多態性；種間遺傳分化(F-ST)表明，種間同工酶變異占51.3%，種間遺傳變異占48.7%；總雜合度(H-T)和附加內遺傳多樣性(H-S)的平均值分別為0.352和0.171；間遺傳多樣性(D-ST)為0～0.424，平均為0.180；該結果證明了萵苣多起源的假說。因此，這種高度的遺傳變異證明同工酶對萵苣的多態性分析是有效的。Ahmed等[29]采用同工酶分析技術，對沙特阿拉伯的7種茄屬植物的遺傳變異及親緣關系進行研究，結果發現，茄屬植物多態位點的比例從黑穗病菌的0.87位點到白穗病菌的0.80位點，平均雜合度在0～1.00，平均期望雜合度在0～0.50；該結果證實了所研究的茄屬植物具有廣泛的遺傳多樣性。

2.2同工酶在疾病診斷和監測中的應用同工酶具有器官特異性，特定的同工酶只在特定的器官組織發揮作用，當其發生變化時，則預示著組織病變或其他不正常的變化[30-31]。通過對這些同工酶的檢測，可迅速定位病變組織和疾病的類型，為臨床疾病的診斷提供了重要依據[29-32]。肌酸激酶(CK)及其同工酶CK-MB是目前國內外常用于臨床診斷心肌是否發生病變的重要酶學檢測指標[33]。此外，對丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)、乳酸脫氫酶(LDH)及其同工酶等同工酶的研究結果也預示著同工酶在未來可能作為重要的疾病診斷的檢測指標[34]。Lu等[35]研究了丙酮酸激酶同工酶M2(PKM2)的表達對肝癌的臨床特征及預后的影響，結果表明，PKM2高表達組(≥11.25%)與PKM2低表達組(<11.25%)相比，肌酐水平顯著降低(P=0.043)，胎蛋白水平顯著升高(P<0.001)；同時，PKM2表達高的患者與PKM2表達低的患者相比預后差；該研究為今后研究肝癌的發病機制和藥物發現提供了有價值的信息。林娜等[36]對血清乳酸脫氫酶(LDH)及其同工酶M、H亞單位值在復治多發性骨髓瘤(MM)中的作用進行研究，結果表明，對于復治復發性骨髓瘤患者，血清LDH同工酶與ISS分期及腎功損害的程度密切相關，LDH同工酶測定比總LDH活性更具有臨床價值。乳酸脫氫酶主要催化乳酸和丙酮酸之間的相互轉換，在癌細胞有氧糖酵解代謝途徑中扮演關鍵角色。LDH同工酶家族成員的特征、基因表達及其在腫瘤診斷中具有十分重要的意義[37]。許多研究者也致力于同工酶在禽類疾病檢測方面的應用，并取得了顯著的成果。李楊等[38]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳檢測技術，對乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖磷酸異構酶(GPI)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)等同工酶酶譜進行了分析，并結合3株柔嫩艾美耳球蟲的耐藥情況，發現敏感株與耐藥株之間的3種同工酶酶譜存在差異，敏感株間無差異，耐藥株間有差異，同時各酶的結果也不一致。說明在建立參考株與單一藥物耐藥株同工酶酶譜的情況下，可以用同工酶檢測法對球蟲進行耐藥性檢測。

2.3同工酶在種質鑒定中的應用同工酶中氨基酸的排列順序決定了同工酶的種類，而氨基酸的排列順序是由編碼該蛋白的基因決定的，因此蛋白變化能反映DNA分子水平上的變化，同工酶分析是蛋白質分子水平上研究物種遺傳分化、分析鑒定的有效手段。王晗等[6]對黑龍江省主栽的2個黑木耳品種采集的10個不同地區引種的栽培菌株進行了EST同工酶酶譜多樣性比較研究，結果表明，10個菌株EST同工酶酶譜共有8條譜帶，相似酶帶較多，相似系數在0.81～1.00；在相似水平為0.81時，可將10個菌株分為3個組群，第1組群包括8個菌株，第2、第3組群各1個菌株，同一品種不同來源引種的菌株酶譜差異顯著，而不同品種的酶譜卻無差異，表明用種市場菌種名稱較為混亂。郭海林等[39]對結縷草屬14個雜交組合的親本與后代的POD與EST同工酶酶譜進行分析，結果表明，結縷草的雜交后代在酶帶數目以及酶帶活性強弱方面與雙親存在較大的差異，而且還出現了數量不等的雙親所沒有的“特征酶帶”；在所鑒定的44個后代中，有25個后代具有父本的特征帶，2個后代具有其他任何材料均沒有的一條特征帶，這27個后代可以初步鑒定為真雜種。陶芳等[40]分析了雜交水稻不同發育時期材料、不同取材部位EST的表達，結果表明，3～4 d芽齡的幼苗為最適宜的鑒定時期，取材部位不影響標記酶帶的表達，并發現互補型在種子真實性和純度鑒定中具有一定利用價值。尹明華等[16]利用分析紅芽芋低溫療法脫毒苗SOD、POD 和CAT 同工酶酶譜的方式對其遺傳穩定性進行了研究，該研究為脫毒苗的遺傳穩定性檢測提供一些同工酶方面的依據。

3 同工酶檢測的發展前景

近年來，隨著分子生物學技術的迅速發展，同工酶分析技術愈加成熟，應用更加廣泛，目前該技術已在動植物、微生物、農業生產、醫學等眾多領域廣泛應用。目前，同工酶的檢測技術在植物分類研究、種質鑒定和疾病檢測方面應用較為廣泛。由于植物在差異較大的環境中生長時其形態特征變化很大，因而傳統的形態學分類法受到了很大的限制，分子生物學的方法雖然結果準確，可信度高，但其費用較高，試驗操作較為復雜，限制了其應用。而同工酶檢測技術利用檢測基因表達的直接產物的變化，間接反映DNA分子中的變化，其具有組織特異性和物種特異性的特點，且該方法費用低、操作簡單、結果易于分析，在物種分類和遺傳鑒定方面具有十分可觀的應用前景。

從商業化的角度出發，作為蟹中之冠的陽澄湖大閘蟹近年來紅遍大江南北，據報道，目前市場上出售的陽澄湖大閘蟹基本都是冒充貨，但到目前為止，沒有有效的檢測方法，給市場監管帶來了很大的困難，也給消費者帶來了巨大的損失。同工酶在不同生長環境下具有顯著的表達差異，因此可通過同工酶檢測技術，對陽澄湖大閘蟹進行鑒定，規范市場秩序，保障消費者的利益。此外，近年來，中藥材資源的短缺，市場價格飆升，導致大量的不法商販以次充好，用品質差的藥材冒充道地藥材，謀取利益。同工酶在種質鑒定中的優勢，可用于中藥材資源的鑒定。

在醫學研究和疾病診斷方面，一般當人們發現患病時已經是中晚期，錯過了最佳的治療階段，給臨床治療帶來了很多麻煩，同時也給患者帶來了更多的痛苦。隨著研究的深入，越來越多的同工酶與組織病變的關系更加清晰，診斷將更及時、更準確，切實地幫助患者早診斷、早治療、早治愈。綜上所述，同工酶在諸多領域都具有潛在的優勢和廣闊的應用前景。