通腑化濁涼血方對慢性腎衰竭模型大鼠硫酸吲哚酚清除的影響

蔡燕杰，孫曉光,桑小普，馬重陽，翟昌明，程發峰

(北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是指慢性腎臟病引起的腎小球濾過率下降及與此相關的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征[1]，其影響因素頗多，發病因素復雜，防治需多方面合作，近些年來發病率呈明顯提高的趨勢，嚴重威脅著人類的健康[2]。

近年來，有研究發現在CRF患者的腸道內，有大量未知的代謝產物，其中有一類是潛在的尿毒癥毒素，這些尿毒癥毒素主要分為4類：小分子毒素、中分子毒素、與蛋白結合的小分子化合物和蛋白質等[3]，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfuric,IS)是目前研究較多的腸源性尿毒癥毒素之一。這些尿毒癥毒素經過一系列途徑進一步加重CRF的進程和并發癥的發生。本實驗旨在觀察通腑化濁涼血方對慢性腎衰竭大鼠血清中IS的清除效率，為IS的清除策略以及慢性腎臟病的治療方案提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠60只，體質量(180±40)g，由北京中醫藥大學科研實驗中心實驗動物部提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥物與試劑

通腑化濁涼血方(組成：荊芥6 g，防風6 g，白芷6 g，獨活6 g，生地榆10 g，赤芍10 g，丹參10 g，茜草10 g，萆薢30 g，土茯苓30 g，生大黃10 g，為北京同仁堂藥業股份有限公司提供)；尿毒清顆粒(廣州康臣藥業有限公司)；硫酸吲哚酚標準品(美國Sigma公司)；甲醇(北京百諾威生物科技有限公司)；乙腈(德國 Merck 公司)；三氟乙酸(上海鈺博生物科技有限公司)；青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)；水合氯醛(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器

Waters515型高效液相色譜儀;配717型自動進樣器;2475型熒光檢測器(美國Waters公司);BDS HyPersil C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特);METTLER TOLEDO AL-204電子分析天平(梅特勒儀器上海有限公司);KH19A型臺式高速高性能離心機(湖南凱達科學儀器有限公司);MVS-1旋渦混合器(北京金紫光科技發展有限公司產品)。

1.4 造模與分組

慢性腎衰竭大鼠模型的建立按照文獻報道的方法造模，建立5/6腎切除法慢性腎衰竭大鼠模型。手術組(包括模型組，通腑化濁涼血方高、中、低劑量組，尿毒清組)均在無菌條件下進行5/6腎切除術，空白組不作任何處理。5/6腎切除術分兩次完成。第一次手術切除左腎上、下極各1/3，在一周后進行第二次手術，切除整個右腎[4]。兩次手術在手術過程中均在腹腔內注入注射用青霉素鈉1 mL，由內而外縫合，術后單籠飼養并觀察，以確保大鼠術后生存率。

按照隨機數字表隨機分為空白組、模型組(等量生理鹽水)、通腑化濁涼血方高劑量組、通腑化濁涼血方中劑量組、通腑化濁涼血方低劑量組和尿毒清組,每組10只，于動物房中適應性飼養1周，環境要求溫度、濕度均恒定。

1.5 中藥的備制與給藥

以人的等效劑量記作中劑量，1/2倍等效劑量為低劑量，2倍為高劑量，按照人與大鼠體表面積換算公式，中藥以蒸餾水浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，水浴加熱蒸發濃縮至含生藥分別為0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL，放在4℃冰箱中備用。中藥的每日灌胃量為0.2 mL/10 g體質量。

從第5周開始，開始灌胃給藥。模型組每日給以0.2 mL/10 g體質量生理鹽水，通腑化濁涼血方組按照高中低劑量每日大鼠每日0.2 mL/10 g體質量湯藥，尿毒清組每日0.2 mL/10 g尿毒清顆粒溶液，至第16周結束?？瞻捉M不作任何處理。

此16周在整個實驗過程中所有大鼠進水及飲食均不受限制。

1.6 取材時間

在第4周末，每組中隨機抽取3只大鼠，頭身部固定，局部消毒后于尾靜脈取血，檢測肌酐、尿素氮水平，數據顯示慢性腎臟病大鼠造模成功。

在第16周末采集血、尿標本。采集尿標本用代謝籠留取SD大鼠24 h尿標本，同時禁食。收取后立刻送檢。采集血標本于12 h前將各組SD大鼠禁食、禁水。大鼠稱質量后，以0.3 mL/100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉成功后予腹主動脈采血，保存于無肝素采血管中，靜置30 min，離心機3 000 r/min離心，用移液槍移取出血清上清液20 μL，10 min后將血清樣本送檢。

1.7 血清生化和尿蛋白檢測

生化檢測大鼠尿素氮、肌酐、尿酸以及大鼠24 h尿蛋白定量，委托北京中醫藥大學科研樓全自動生化分析室檢測。

1.8 硫酸吲哚酚檢測

采用高效液相色譜-熒光分析法檢測血清中硫酸吲哚酚含量。用移液器精密吸取血清100 μL，加入300 μL乙腈后渦旋30 s，待二者充分混合，以12 000 r/min轉速離心8 min。吸取200 μL上清液，進樣時取10 μL置于自動進樣小瓶中進行分析。色譜分離通過BDS HyPersil C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特)完成，流動相為乙腈-水-三氟乙酸(15：85：0.2，V/V/V)；流速為1 mL/min；柱溫：40 ℃；激發波長280 nm，發射波長390 nm。IS標準曲線設定為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg/mL。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠的動作敏捷，體毛致密光滑、整齊有光澤，耳廓、口唇、眼鼻黏膜紅潤，體質量正常增長，尿量正常，尿色淡黃，大便成形質偏硬，飲水飲食均正常。

模型組大鼠逐漸出現精神萎靡的現象，身體多蜷縮，且反應遲鈍，活動遲緩，口唇等黏膜蒼白無血色，皮毛無光澤，毛量偏少，食少飲多，大便溏稀，尿量多，體質量增長緩慢。

尿毒清組整體狀況較模型組相比有改善，但較通腑化濁涼血方各組差。

通腑化濁涼血方各組在毛色、口唇黏膜顏色方面較模型組明顯改善。精神狀態較活躍，體質量增長較正常。

2.2 通腑化濁涼血方給藥3個月后各組血清尿素氮與肌酐水平的變化

表1 給藥3個月后各組血清尿素氮與肌酐水平的變化

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3個月后模型組血清尿素氮(BUN)與肌酐(SCr)水平均較兩個月上升，表明本模型慢性腎衰持續進展，且不能自陷。與模型組相比，通腑化濁涼血方中、高劑量均可以降低模型大鼠血清BUN水平(P<0.05)，三個劑量均能夠明顯降低SCr水平(P<0.05)，證明本方具有緩解腎功能衰竭的作用。

2.3 通腑化濁涼血方給藥3個月后尿蛋白水平的變化

24 h尿蛋白定量檢測結果顯示，通腑化濁涼血方給藥3個月后，與正常對照組相比，模型組大鼠出現明顯蛋白尿(P<0.01)。與模型組比較，三個劑量通腑化濁涼血方組大鼠24 h尿蛋白均有不同程度下降(P<0.01)，提示通腑化濁涼血方對大鼠腎衰后蛋白尿具有劑量依賴性治療作用。

表2 給藥3個月后24 h尿蛋白水平的變化

注：與模型組比較，**P<0.01

2.4 各組大鼠硫酸吲哚酚測定結果比較

慢性腎衰竭大鼠3個月血清IS水平較空白組明顯上升(P<0.01)，低中高通腑化濁涼血方能夠減少大鼠血清IS含量(P<0.01)，具有劑量依賴性。

表3 給藥3個月后IS測定

注：與模型組比較，**P<0.01

愈來愈多的證據表明，在CRF的病理機制中，腸道和腎臟之間有著重要的聯系，并提出了新的理論——“腸-腎軸”(Gut-Kidney Axis)[5]，腸道與腎臟之間的密切關系表現為，隨著腎功能的減退,腎臟對溶質的清除率下降，血液和組織中不斷蓄積毒性物質——尿毒癥毒素，毒素使腸道菌群生態失調，菌群生態的改變使毒素的產生增加；同時，毒素造成腸道黏膜屏障功能紊亂，導致內毒素進入血液循環，形成腸源性內毒素血癥；毒素還可以通過腸道動力障礙、免疫功能異常、全身炎癥反應等途徑進一步加重CRF的進程和并發癥的發生[6-8]。

現在慢性腎衰竭常用的治療手段是腎替代，如血液透析、腹膜透析等方法，成本均較高，且對于IS等蛋白結合型毒素清除率較低，容易對患者的生活質量產生影響[9]。

趙紹琴教授是治療腎病的大家，通過多年的臨床總結出一整套CRF的辨證方法，趙老認為，CRF是泌尿系統疾病，不能等同于中醫“腎”的概念，其基本病機為風、濕、熱邪深入營血，脈絡瘀阻，其病屬實非虛，多熱多瘀。彭建中教授是趙紹琴教授的學術繼承人，在秉承趙紹琴學術思想的基礎上，對該病進行了更為深刻認識，通過對大量臨床病例的觀察與總結，認為CRF不僅是泌尿系統的疾病，更與胃腸道消化系統密切相關，并將本病的關鍵環節定義為“濕熱毒”，研究出通腑化濁涼血方。此方是基于兩代名中醫的學術經驗創立而成的，是彭建中教授治療慢性腎衰竭的基本方，臨床療效顯著，并在動物實驗中得到驗證[10]。

通腑化濁涼血方的立方宗旨在于解決CRF中蓄積在腎與三焦的“濕熱毒”。其藥物組成中的生大黃苦、寒，歸脾、胃、大腸經，通腑導滯，減少腸道內腐敗物的潴留時間，改善腸道菌群的失調狀態，使毒素的產生來源減少；萆薢苦、平，歸腎、胃經，土茯苓甘、淡、平，歸肝、胃經，化濁排毒，降低體內已經產生的毒素；荊芥、防風、白芷、獨活疏風祛濕，生地榆、赤芍、丹參、茜草涼血活血，清熱解毒，減輕毒素導致的毒性作用。全方共奏通腑導滯、化濁排毒、涼血解毒之效。大腸屬下焦，本是糟粕形成的部位，更加容易感受“濕熱毒”邪。在腸道內發現的尿毒癥毒素極有可能是中醫所說的“濕熱毒”邪，或是通腑化濁涼血方的作用靶點。

實驗證明，通腑化濁涼血方可以增加CRF模型大鼠排便次數，改善食欲，降低血中的IS含量，但對IS的干預機制目前尚未可知。研究通腑化濁涼血方對IS的干預機制或能發現該方治療CRF的機制之一，從而為臨床治療慢性腎臟病提供思路。

慢性腎衰竭是現如今臨床上一種難治的疾病，尋找有效的治療措施是亟待解決的問題。努力挖掘中醫藥治療慢性腎衰竭的經驗價值，是中醫藥學者的職責。我們應在秉承中醫傳統的基礎上，挖掘名老中醫寶貴的臨床經驗，結合現代研究進展與先進的實驗技術，發揚中醫藥在治療慢性腎衰竭方面的積極作用，為IS等類尿毒癥毒素的清除策略和慢性腎衰竭的治療方案提供新的思路與方法。