三陽清解液乙狀結腸滴注對內毒素誘導大鼠發熱模型解熱機制的研究

湯瑞蓮，王曉燕

(鄭州市中醫院，河南 鄭州 450007)

小兒外感發熱是兒科常見病、多發病，屬中醫“感冒”范疇，小兒患病“傳變迅速”，易入里化熱，小兒“脾常不足”，感邪之后易乳食停滯，故小兒感冒以風熱夾滯證多見，而小兒臟腑薄、藩籬疏，易于傳變，往往太陽表證未解而病邪即入少陽半表半里，正邪交爭，引動膽經郁熱，上迫心神，橫逆犯胃，而致小兒就診時大多太陽、少陽、陽明三陽癥并見。三陽清解液是河南省首屆名中醫王曉燕教授用于治療小兒外感發熱(風熱夾滯型)的臨床效驗方，依據張仲景六經辨證理論，在柴葛解肌湯、大柴胡湯、白虎湯基礎上衍化而來，臨床使用二十余年，療效確切[1-2]、不良反應小。本研究通過觀察三陽清解液乙狀結腸滴注對LPS誘導發熱模型大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量和血清IL-1β、TNF-α、PGE2的含量的影響，旨在探討其可能的解熱機制，為臨床應用提供實驗依據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

Wistar大鼠，級別：SPF級；雌雄各半；購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 實驗藥物

三陽清解液組：葛根5 g,柴胡12 g,黃芩10 g,生石膏30 g,生梔子10 g,莪術6 g,生大黃4 g,甘草3 g，以上為1劑量，水煎、過濾和濃縮，制備濃縮成每毫升含生藥80 g的水煎液，裝瓶備用,根據實驗需要調制所需濃度；由鄭州市中醫院制劑室提供；泰諾林混懸液(對乙酰氨基酚口服混懸液)，規格：3.2 g/100 mL，上海強生制藥有限公司生產，批號161223070。

1.1.3 實驗試劑

脂多糖(LPS)(100 mg)，購自索萊寶科技有限公司；氯化鈉注射液(0.45 g，250 mL)，河南太龍藥業有限公司；大鼠環磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒，均購自深圳子科生物科技有限公司。

1.1.4 實驗儀器

MC-347歐姆龍電子體溫計，大連歐姆龍有限公司生產TDL80-2B離心機，SpectraMax190型酶標儀(美國熱電)，上海安亭科學儀器廠生產；HW-1000超級恒溫水浴，成都泰盟軟件有限公司生產；BT100-2J蠕動泵驅動器，保定蘭格恒流泵有限公司生產。

1.1.5 致熱源及發熱模型制備

致熱源制備：無菌條件下，用0.9%氯化鈉溶液將脂多糖(LPS)配成20 mg/L注射液，備用。

發熱模型制備：實驗前12 h，禁食不禁水。灌腸給藥后立即造模：空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1 mL/kg，其余各組大鼠分別腹腔注射的LPS(20 μg/kg，1 mL/kg)建立大鼠發熱模型。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選、分組及用藥

實驗給藥前，每天上下午定時(上午8∶30，下午4∶30開始)對大鼠進行適應性測量口腔溫度1次，連續2 d，取兩次體溫的平均值記為基礎體溫。測量時保持時間、地點、環境條件的一致性，測量探頭從大鼠口角插入口腔舌下并保證每次定位角度一致，動作輕柔防止體溫應激性增高。體溫超過正常范圍或相鄰兩次體溫差值大于0.5℃的動物剔除。選用基礎體溫合格的大鼠40只，隨機分為4組，每組10只，雌雄各半。分別為①空白組：腹腔注射生理鹽水1 mL/kg；②模型組：腹腔注射20 μg/kg LPS，1 mL/kg；③對乙酰氨基酚組：予對乙酰氨基酚口服混懸液，4 mL/kg灌胃給藥；④三陽清解液組：腹腔注射20 μg/kg LPS，1 mL/kg；30 mL/kg的相應藥物約按20滴/min的速度乙狀結腸滴注給藥。

1.2.2 乙狀結腸滴注給藥

為了更好地檢驗浙江省對外直接投資對出口貿易和進口貿易的不同影響，本文建立如下出口效應模型和進口效應模型:

將篩選好的各組大鼠用固定筒固定好，使其保持安靜狀態且臀部輕微向上抬起，灌腸給藥前先輕輕擠出直腸內殘留的糞便，將藥瓶連接涂有石蠟的一次性滴注導管，將其輕緩插入肛門3 cm，以20～25滴/min的速度滴注給藥，藥物全部滴入后，導尿管停留片刻再輕緩退出，并使大鼠繼續保持灌腸時的姿勢，以避免灌腸藥物流出影響藥效。灌腸給藥前12 h各組大鼠禁食不禁水，以減少糞便對藥物的干擾。

1.2.3 標本制備

血標本制備：各組大鼠于給藥后6 h將大鼠麻醉后，采用腹主動脈采血5 mL留取血標本，然后以3 000 r/min，離心15 min，分離血清，置于-80℃冰箱冷凍，待ELISA檢測用。

下丘腦標本的制備：各組大鼠于腹主動脈采血后立即斷頭處死動物，沿矢狀縫剪開皮膚，剝去兩側頂骨、顳骨和硬腦膜，迅速取出腦組織，根據解剖標志(視交叉、乳頭體為前后界，左右下丘腦溝為側界，深約4 mm)，制備下丘腦組織塊約4 mm×4 mm×4 mm。然后立即把一半下丘腦組織放入凍存管，置液氮中速凍后保存于-80℃冰箱，待ELISA檢測用。

1.3 觀測指標

1.3.1 體溫

造模后1、2、3、4、5、6 h測量口溫，計算各組大鼠在各測溫點的升溫值(△T=實測體溫-基礎體溫)，測量體溫的同時，觀察大鼠皮膚、毛色、肢體、精神狀況、飲食、飲水、大小便、呼吸、體質量的變化情況。

1.3.2 下丘腦及血清指標

1.4 統計方法

2 結果

2.1 給藥6 h內各組大鼠體溫變化趨勢

如表1所示：模型組大鼠體溫明顯上升，與空白組對比存在顯著性差異(P<0.05)，體溫呈典型的雙峰熱，在2 h、5 h有2個熱峰，升溫值達到1.43℃，且實驗過程中觀察到部分發熱模型大鼠出現精神萎靡、豎毛、寒顫的癥狀，表明LPS發熱大鼠模型造模成功，與報道[3-5]相符；與模型組比較，三陽清解液組和對乙酰氨基酚組體溫下降明顯(P<0.05)；三陽清解液組與對乙酰氨基酚組在給藥1、2 h退熱效果比較，差異有統計學意義(P<0.05) ，而在給藥4、5、6 h比較，差異無統計學意義(P>0.05) ，說明三陽清解液組可以顯著降低發熱大鼠的體溫，且作用時間長，不易反彈。

2.2 給藥后發熱大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量變化比較

如表2所示：造模給藥6 h后，模型組大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2含量較空白組顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，對乙酰氨基酚組能夠明顯減低發熱大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2含量(P<0.01)，三陽清解液組對發熱大鼠下丘腦組織勻漿中cAMP、PGE2的水平也有一定的抑制作用(P<0.05)；與對乙酰氨基酚組比較，三陽清解液組下丘腦組織勻漿中cAMP含量，差異有統計意義(P<0.05)，PGE2含量，無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠給藥后不同時間△T的變化比較℃)

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

表2 各組大鼠下丘腦cAMP、PGE2含量變化比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

2.3 給藥后各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、PGE2含量變化比較

如表3所示：造模給藥6 h后，模型組動物血清中IL-1β、TNF-α、PGE2含量較空白組顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，對乙酰氨基酚組及三陽清解液組能夠明顯減低發熱大鼠血清中IL-1β、PGE2的含量(P<0.01)，三陽清解液組對發熱大鼠血清中TNF-α的水平也有一定的抑制作用(P<0.05)；與對乙酰氨基酚組比較，三陽清解液組血清中TNF-α差異有統計意義(P<0.05)，而IL-1β、PGE2無明顯差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α及PGE2含量變化比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與對乙酰氨基酚組比較，☆P<0.05

3 討論

發熱是由于發熱激活物刺激內生致熱原細胞產生內生致熱原，內生致熱原通過中樞發熱介質作用于體溫調節中樞而使體溫調定點上移而引起的調節性體溫升高。PGE2、cAMP是目前公認的體溫調節中樞發熱介質[6-10]，IL-1β和TNF-α是目前公認的可誘導發熱的重要炎性遞質[11-13]，對乙酰氨基酚屬非甾體抗炎藥，其機理是抑制體內PGE2等的合成，阻止致熱源引起的發熱反應。LPS是目前公認的導致發熱效應很強的外源性致熱源之一，是革蘭陰性細菌內毒素的活性成分，它能夠刺激機體產生內生性致熱原，引起強烈的炎癥反應，從而使體溫升高[14]。諸多研究[15-16]顯示腹腔注射小劑量LPS(20 μg/kg)可成功誘導出大鼠發熱模型。動物注射LPS后可引起下丘腦PGE2、cAMP含量升高，且與體溫升高呈顯著性正相關[17]，IL-1β和TNF-α作為引起發熱的重要內生致熱源在LPS發熱中起著重要作用[11-13]。本實驗采用腹腔注射LPS建立大鼠發熱模型，大鼠血清中的TNF-α均顯著性升高，這與Liu等[18]的結果相一致，注射LPS劑量為20 μg/kg可引起典型的雙峰熱，與王雪峰等[11]報道一致。

三陽清解液方主要由葛根、柴胡、黃芩、生石膏、生梔子、莪術、生大黃、甘草等組成。方中葛根辛涼解肌入太陽；柴胡輕清升散，黃芩清瀉相火，和解少陽；大黃蕩滌陽明腑熱；石膏清陽明氣分之實熱；梔子苦寒，能清三焦濕熱；莪術活血化瘀、消積行氣；全方共奏辛涼解表、和解少陽、清瀉陽明之效。采用乙狀結腸滴注的給藥途徑，有效解決了“小兒吃藥怕苦、打針怕疼”的難題，大大提高了依從性；在研究前期我們發現三陽清解液乙狀結腸滴注時反復測肛溫會刺激大鼠肛門，致灌腸藥物流出，為了不影響藥物效果及體溫測定，我們采用測口溫的方法；同時采用恒溫水浴保證藥物在37.0℃左右，避免了溫度過高、過低對大鼠造成不適；另外，采用恒流泵泵入的方法解決大鼠在灌腸過程中因為腹壓過大等，造成滴注緩慢或不滴等問題，經過以上技術上的改良，保證了實驗的合理性及可操作性；相關前期研究發現[1]三陽清解液乙狀結腸滴注對LPS誘導的發熱模型大鼠有良好的解熱作用，且有較好的劑量依賴性，其解熱效果可能與其抑制發熱大鼠血清中IL-6、MIP-1的含量相關，本研究在此基礎上調整實驗設計方案，完善相關檢測指標，以期通過觀察三陽清解液對LPS誘導發熱模型大鼠體溫及下丘腦中發熱介質和血清中致熱因子含量的影響，探討其可能的解熱機制。

本研究發現LPS造模后大鼠呈典型的雙峰熱，模型組大鼠體溫明顯上升(P<0.05)，提示造模成功；三陽清解液能明顯降低發熱大鼠體溫，三陽清解液組與對乙酰氨基酚組在給藥1、2 h退熱效果比較，差異有統計學意義(P<0.05) ，而在給藥4、5、6 h比較，差異無統計學意義(P>0.05) ，說明三陽清解液組可以顯著降低發熱大鼠的體溫，且作用時間長，不易反彈；與空白組比較，模型組大鼠下丘腦cAMP、PGE2及血清IL-1β、TNF-α、PGE2含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，對乙酰氨基酚及三陽清解液組大鼠下丘腦cAMP、PGE2及血清IL-1β、TNF-α、PGE2含量顯著下降(P<0.05)，其中三陽清解液組下丘腦PGE2及血清IL-1β、PGE2與對乙酰氨基酚組無顯著差異(P>0.05)。

綜上所述，三陽清解液對LPS誘導的發熱大鼠模型有良好的解熱作用，且作用穩定持久，其機制可能與通過下調大鼠下丘腦cAMP、PGE2水平，從而抑制血清IL-1β、TNF-α、PGE2的表達有關。