煙草及煙用香精香料中氨基酸檢測方法研究進展

張萌萌，楊 芳

(陜西中煙工業有限責任公司 技術中心，陜西 寶雞 721000)

煙草中的含氮化合物對卷煙評吸質量和消費者的健康有重要影響，因此受到研究者的普遍關注. 而氨基酸作為一類重要的含氮化合物，其含量與煙草品質有著密切的關系，直接影響著煙草吸味和煙氣的豐滿度. 游離氨基酸一方面與還原糖之間發生酶促以及非酶促棕色化反應，生成具有多種香味特征的吡嗪、吡喃、吡咯等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸自身還會分解，生成具有香味物質的化合物，如苯甲醇、苯乙醇等. 適量氨基酸有助于提高煙氣勁頭和增加豐滿度，若過量則會產生刺激性，對卷煙吸味產生不良影響[1-4]. 因此，準確定量煙草和煙用香精香料中的氨基酸對卷煙配方設計優化具有重要的意義.

1958年，Spackman D H, Moore S等[5]發現了氨基酸自動分析的方法. 隨著氣相色譜、液相色譜以及檢測器技術的發展，氨基酸的檢測方法也得到了完善和拓寬. 根據是否衍生，氨基酸分析方法可以分為直接檢測法和間接檢測法. 間接檢測法根據衍生的時機不同，可分為柱前衍生法和柱后衍生法. 本文旨在對比不同方法的優劣勢，以期為煙草以及其他行業進行氨基酸分析的研究者提供參考.

1 直接檢測法

1.1 高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法

高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法無需衍生、操作簡便、靈敏度高，對氨基酸的檢出限可達到pmol或fmol. 但是由于該方法能夠檢測羥基，因此能夠檢測糖. 煙葉中含有大量的糖類，這些物質會干擾煙葉中氨基酸的定量分析，因此必須除去. 潘媛媛等[6]采用自填裝的DVB強酸性陽離子交換樹脂柱離線去除了煙葉和煙草料液中的糖類化合物，以AminoPac PA10陰離子交換柱，NaOH和NaAc的強堿性溶液為淋洗液，積分脈沖安培法對氨基酸進行檢測，回收率達76%～105%. 于宏曉等[7]先用商品化的SCX固相萃取小柱離線去除煙葉中糖類和色素，然后用離子色譜-積分脈沖安培法同時測定了煙草中18中游離氨基酸的含量，平均回收率80%～115%，最低檢出限0.03～0.75 μg/mL,線性相關系數0.990 0～0.999 2.

1.2 高效液相色譜-串聯質譜法

高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)具有靈敏度高、選擇性好的優點，無需對樣品進行衍生化和固相萃取等復雜前處理，大大提高了分析效率. 同時，串聯質譜還具有特征離子提取功能，對待測物質的色譜分離度要求較低[8].

張婕等[9]采用LC-MS/MS建立了同時測定煙草中16種氨基酸和6種Amadori化合物的快速分析方法，方法簡便快速，靈敏度高，特異性強. 馬戎等[10]建立了LC-MS/MS測定煙草中20種游離氨基酸的方法，樣品超聲萃取并離心后直接進樣測定，方便快捷，20種氨基酸的檢出限為0.001～0.01 μg/mL，回收率86.4%～105.9%. 鄧其馨等[11]利用LC-MS/MS的方法測定了煙用香精香料中的18種氨基酸，該方法分析速度快，靈敏度和準確性高，重復性好.

1.3 高效液相色譜-蒸發光散射檢測法

蒸發光散射檢測器作為一種通用型檢測器，能建檢測任何揮發性低于流動相的物質，是紫外檢測器的有效補充，廣泛的應用于化學、食品、藥品等行業. 利用高效液相-蒸發光散射檢測器檢測氨基酸，具有檢測時間短、靈敏度高的優點.

白玉靜等[12]建立了用高效液相-蒸發光散射檢測器測定清開靈注射液中氨基酸含量的方法，此方法對清開靈注射液中的19種氨基酸進行了含量測定，增加了清開靈注射液的質量控制指標. 鄢丹等[13]建立了高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法同時測定中藥阿膠中17種氨基酸含量的方法，在優化的條件下，在25 min內即可完成對阿膠中17種氨基酸的分離鑒定.

1.4 傅里葉變換近紅外光譜法

傅里葉變換近紅外光譜(FT-NIR)技術因其快速、非破壞性及多組分同時定量分析等優勢，近年來已成功應用于煙草、食品、藥品、化工等諸多領域產品的分析測定. FT-NIR用于氨基酸測定的不足之處在于低質量分數的氨基酸對NIR光譜信號反應程度較弱，建模效果不理想[14-17].

荊磊磊等[14]采用偏最小二乘法為建模方法，建立了煙草中組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸以及游離氨基酸總量的近紅外預測模型. 結論表明，樣品的預測值和實際值間的相關性良好，而且，在顯著性水平0.05時，NIR光譜分析法測得值與標準方法不存在顯著性差異，表明所建模型準確可靠. 柯藝萍[15]也使用偏最小二乘法為建模方法，采用二階導數和Norris濾波法進行光譜預處理，建立了煙葉中氨基酸含量的預測模型，與常規標準檢測方法相比，結果表明，可以較為準確的測定煙葉中氨基酸的含量.

1.5 毛細管電泳-紫外檢測法

常用的毛細管電泳-紫外檢測法是選取合適的緩沖溶液，使樣品溶液形成穩定的電滲流體系. 通過控制緩沖溶液的pH來實現氨基酸的分離，常用的緩沖溶液體系是磷酸鹽和硼砂.

周賢婧等[18]考察了磷酸濃度、進樣方式和緩沖液pH對分離效率和重現性的影響. 在分離電壓為-15 kV、檢測波長為220 nm條件下，以含有0.5 mmol /L十六烷基三甲基溴化銨、20 mmol /L煙酸、10%甲醇的10 mmol /L磷酸二氫鈉緩沖溶液( pH 10.2)為運行緩沖液，9種組分在11 min內達到基線分離,檢出限最低可達到0.3 mg /L. Chen等[19]研究了水楊酸鹽、苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽和偏苯三甲酸鹽作為背景電解質，結果表明苯甲酸鹽的響應最為靈敏. 在pH為11.20，紫外光225 nm，緩沖溶液選擇10 mmol的苯甲酸和1 mmol陽離子表面活性劑肉豆蔻酰三甲基溴化銨(MTAB)，可以分離17種氨基酸的混合物，檢測限為10～50 μmol. 童萍[20]建立了一種簡單快速測定不同產地太子參藥材中9種氨基酸的毛細管電泳-間接紫外檢測方法，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節14 mmol/L的對氨基苯磺酸至pH為11.2作為運行緩沖液，在分離電壓20 KV時，9組分在12 min內實現了完全分離.

2 間接檢測法

2.1 柱前衍生法

2.1.1 氣相色譜法

氣相色譜法分析氨基酸具有分析速度快、靈敏度高等特點，但是需要提前對氨基酸進行衍生化，常用的衍生化試劑有鄰苯二甲醛、異硫氰酸苯酯、氯甲酸芴甲酯、2,4-二硝基氟苯、N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺等，每種衍生化試劑都有其適用性和局限.

劉百戰等[2]基于氯甲酸乙酯衍生化，建立了一種用于煙草中游離氨基酸測定的毛細管氣相色譜法. 該方法簡單，衍生化可在水溶液中進行且速度快，所生產的衍生物較穩定，重現性和回收率均令人滿意. 黃志等[4]采用對氨基酸進行硅烷化，然后在選擇離子監測模式下進行GC/MS分析，內標法定量. 結果表明，18種氨基酸的定量標準曲線線性良好，方法的加標回收率為97.4%～114.1%，相對標準偏差為0.17%～3.4%.

2.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法用于氨基酸的測定靈敏、快速并且儀器能夠一機多用，但是同氣相色譜法一樣，需要對氨基酸進行柱前衍生. 鑒于每種衍生化試劑都存在一些問題，因此有研究者嘗試用兩種衍生化試劑聯合衍生.

景延秋等[21]用鄰苯二甲醛/3-巰基丙酸作為衍生劑進行柱前衍生，建立了反相高效液相色譜測定白肋煙煙葉中游離氨基酸的方法，方法的回收率為95.3%～100.7%，RSD為2.32%～9.24%. 陳文等[22]用乙醇的水溶液提取煙葉中的游離氨基酸并通過陽離子交換柱純化后，采用鄰苯二甲醛丹酰氯(OPA)、9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC)聯合在線衍生反相高效液相色譜法對烤煙、白肋煙和香料煙中的游離氨基酸進行了對比研究.

2.2 柱后衍生法

柱后衍生法是首先將樣品通過色譜柱分離，然后用衍生試劑衍生化并檢測. 衍生試劑常用的為茚三酮. 與柱前衍生相比，柱后衍生重復性好.

李娟等[23]采用酸水解法和氨基酸自動分析儀測定了8類天然食用香料浸膏中16種氨基酸的含量，結果表明，除了茉莉浸膏、酒花浸膏、愛普鳶尾浸膏中未檢測到氨基酸外，其他浸膏都含有氨基酸，且種類基本相同，不同浸膏中氨基酸的含量具有顯著性差異. 劉敬業等[24]利用氨基酸自動分析儀研究了不同生育時期、品種、施肥量、葉位以及烘烤前后煙葉氨基酸含量的變化規律. 趙田等[25]利用氨基酸自動分析儀，以四川8種煙草類型的調制后的煙葉為材料，針對不同類型煙葉游離氨基酸的組成和含量進行了比較分析，試驗結果表明，烤煙和香料煙含量最高的兩種氨基酸為脯氨酸和谷氨酸，白肋煙、馬里蘭煙、曬煙中含量最高的氨基酸為天門冬氨酸和谷氨酸.

3 結論

氨基酸檢測技術不斷發展，但是衍生化試劑選擇和試驗條件的優化等一系列問題還待解決. 氨基酸分析儀操作簡便，但是分析時間長，且機器耗材價格偏高. 傅里葉變換紅外技術對于低質量分數的氨基酸建模效果不理想. GC-MS用于氨基酸分析需要提前進行衍生化，易受衍生副產物的干擾. HPLC單獨用于分析時需要衍生化，LC-MS/MS聯用技術一般無需衍生處理，可以直接檢測氨基酸，還有離子提取功能，有望成為氨基酸分析檢測方法改進的方向. CE技術在手性氨基酸分析中有重要應用. 經過不斷完善，前處理簡單、選擇性好、準確度高、分析速度快的氨基酸分析技術將會不斷涌現.