經白色念珠菌脅迫后家蠅新型抗菌肽AMP17表達模式的研究①

馬慧玲 李 妍 蘇佩佩 趙欣宇 楊隆兵 陶如玉 國 果

(貴州醫科大學基礎醫學院，貴州醫科大學環境污染與疾病監控教育部重點實驗室,貴陽 550025)

昆蟲抗菌肽是機體先天免疫防御系統的重要組成部分，當機體受到感染性損傷或免疫刺激后，蟲體可以產生抗菌肽，以抵御病原體入侵，這些抗菌肽對多種病原物如細菌、真菌、病毒及病原蟲均有殺傷作用，且作用機制獨特，不會損傷和破壞高等動物的正常細胞[1-6]。自從七十年代中期瑞典科學家Boman[7]發現昆蟲抗菌肽Cecropins以來，昆蟲抗菌肽已成為生命科學的研究熱點。

病原真菌是昆蟲病原微生物中最大的一類，約有60%以上的昆蟲疾病由病原真菌引起[8]。真菌細胞壁是昆蟲識別真菌的靶位置，昆蟲可通過對病原真菌細胞壁成分的識別實現免疫防御反應。有研究顯示在果蠅、黃粉蟲中，革蘭氏陰性菌識別蛋白-3(GNBP3)可識別真菌細胞壁成分β-1，3葡聚糖，激活免疫信號通路，參與機體先天免疫防御反應[9-11]?？咕氖桥c昆蟲體液免疫密切相關的小分子活性蛋白質。Iijima等[12]從麻蠅(Sarcophaga peregrina)幼蟲血淋巴分離出抗真菌肽AFP,該肽能夠抑制白色假絲酵母(Candida albicans)生長,并可以與真菌結合造成真菌細胞質泄漏導致真菌死亡[12]。昆蟲對外來微生物的抵御是多免疫因子和多免疫組織共同協作的過程。 呂丁丁等[13]研究發現不同家蠶組織在感染白僵菌后，4種抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2 和 lysozyme相對表達水平隨時間的變化也不同，說明不同組織對白僵菌有不同的防御機制。正常情況下，昆蟲幼蟲體內抗菌肽的表達水平不是很高， 但可以被微生物誘導表達。黃玉霞等[14]發現家蠶感染白僵菌后,可能誘導激活Toll信號通路，從而調控 enbocin1 基因上調表達，推測該抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染過程中發揮重要作用。楊雪等[15]研究發現家蠅抗菌肽muscin 基因在血細胞和脂肪體中表達量最高，通過細菌刺激進行免疫誘導后，幼蟲體內該基因的表達水平明顯上調，并在 6 h 達到高峰，推測該基因參與家蠅抗菌免疫反應。

家蠅(Musca domestica)屬于世界性分布的昆蟲，是一種衛生害蟲又是一種重要的資源昆蟲，大量研究表明其擁有強大的先天免疫系統[16-18]。AMP17是本課題組在前期研究中，從微生物誘導的家蠅轉錄組數據組中篩選到一條特異性高表達的基因[19，20]。我們采用原核表達系統，克隆表達并純化得到了重組MD-AMPs-17蛋白，該重組蛋白在體外顯示了較強的抗真菌活性[21]。為了進一步了解該基因在家蠅免疫防御反應中的作用，本研究探討了經白色念珠菌脅迫后，AMP17的時空表達模式，為進一步揭示該蛋白的功能及家蠅抗真菌機制奠定一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物材料與菌種 實驗家蠅由貴州醫科大學病原生物學實驗室飼養，飼養溫度28℃，相對濕度65%，光照周期10L：14D，3齡幼蟲均重26.5 mg。白色念珠菌(ATCC10231)為貴州醫科大學微生物教研室王濤博士惠贈。

1.1.2主要試劑和儀器 Trizol、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA保護劑(均購自大連寶生物TaKaRa公司)；去RNA酶EP管、PCR耗材(美國Sigma公司)；異丙醇、無水乙醇、氯仿、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)及濾紙均購自貴州索萊寶貿易有限公司。

ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、移液器(德國Eppendorf公司)、PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)、顯微解剖鏡(尼康)、顯微超微量注射儀(美國)、Milli-Q超純水儀(法國Millipore Pharmacia公司)、Allegra 64R 冷凍高速離心機(美國BECKMAN公司)。

1.2方法

1.2.1標本制備 將白色念珠菌在沙氏固體培養基上轉種2次，之后挑取單克隆接種于沙氏液體培養基中培養，收集對數生長期的白色念珠菌，用無菌PBS緩沖液將菌液稀釋至1.0×108cfu/ml。以白色念珠菌作為感染源，通過顯微超微量注射儀注射家蠅第2天幼蟲，注射濃度為：1.0×108cfu/ml，注射體積210 nl，設置為實驗組，注射等體積PBS緩沖液為對照組。分別收集顯微注射3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的整蟲標本以及受脅迫后3 h、12 h、48 h 家蠅幼蟲不同組織(體壁、脂肪體、馬氏管、中腸、唾液腺、氣管、血淋巴)標本。

1.2.2家蠅幼蟲組織標本解剖 選取受脅迫后3 h、12 h、48 h家蠅幼蟲,浸泡在盛有生理鹽水的培養皿中，剪頭法收集血淋巴，用小剪刀自蟲體末端沿體壁剪一個小口可見體液溢出，然后小心翼翼沿傷口處剪向頭端。在顯微解剖鏡下用鑷子撥開體壁，分離脂肪體、中腸、馬氏管、唾液腺、氣管。

1.2.3總RNA的提取及cDNA合成 對所收集的標本，按照Trizol法提取總RNA，檢測其濃度和純度后，按照cDNA合成試劑盒說明書分別合成cDNA，于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4引物的設計與合成 以RPS18為內參基因，根據RPS18及AMP17基因的cDNA序列運用primer5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物。引物由TaKaRa公司合成,其序列如下：AMP17-F：5′-TGGGATGTGTTGGTTCCGATT-3′；AMP17-R：5′-CGCTACTTCAATGGAACTGGT-3′。RPS18-F：5′-AAGGGTGTGG-GTCGCCGTT-3′；RPS18-R：5′-GCAATGGGTTGGAGA-TGAT-3′。

1.2.5實時熒光定量PCR 取上述家蠅幼蟲感染后不同時間點(3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h)及感染后3 h、12 h、48 h的家蠅幼蟲不同組織(體壁、馬氏管、脂肪體、腸、唾液腺、血淋巴、氣管)的cDNA(1∶10稀釋)為模板，RPS18為內參基因，按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒說明，使用ABI PRISM7300(ABI，USA)進行real-time PCR，每個樣品重復3次，每組3個重復。 反應體系為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl；上游引物 0.8 μl；下游引物 0.8 μl；ROX Reference DyeⅠ(50×)0.4 μl；cDNA 1.0 μl；ddH2O 7.0 μl。反應程序：95℃預變性10 s；95℃變性10 s，58℃退火1 min，共40個循環。PCR反應結束后收集數據進行分析。

1.3統計學分析 本實驗采用2-ΔΔCT方法計算并分析實驗數據，運用SPSS15.0對實驗數據進行統計學分析，單因素方差分析進行組間比較，以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義，使用Graphpad Prism 5繪圖。

2 結果

2.1AMP17基因在顯微注射感染白色念珠菌的家蠅幼蟲不同時間點的表達情況 經白色念珠菌脅迫后， 實驗組幼蟲的AMP17基因表達量較對照組明顯上調，在48 h該基因表達量達到最高，差異具有統計學意義(P<0.05),其次是3 h、6 h、12 h，差異均具有統計學意義(P<0.05)。而在感染后24 h和36 h，該基因的表達量出現下調趨勢。 總體上家蠅AMP17基因的表達量隨時間的推移呈現先升高后降低再升高的狀態(圖1)。

2.2AMP17基因在顯微注射感染白色念珠菌不同時間點的家蠅幼蟲不同組織的表達情況 根據家蠅感染白色念珠菌后不同時間點AMP17基因的表達情況，選取經脅迫后3 h、12 h、48 h的幼蟲，顯微解剖鏡下分離各組織(圖2)，分析家蠅AMP17基因在各組織(體壁、脂肪體、馬氏管、中腸、唾液腺、氣管、血淋巴)的表達量。在3 h時，以PBS組為對照進行計算，體壁表達量最高，上調了6.59倍，差異具有統計學意義(P<0.01)，其次為氣管，上調了4.74倍；血淋巴和脂肪體呈現下調趨勢(圖3A)。在12 h時，以PBS為對照組進行計算，體壁表達量最高，上調了5.54倍(P<0.01)，其次為血淋巴，上調了1.87倍(P<0.05)；氣管、脂肪及唾液腺呈現下調趨勢(圖3B)。在48 h時，以PBS為對照組進行計算，體壁表達量最高，上調了10.98倍(P<0.05)；其次為唾液腺，上調了7.28倍(P<0.05)。血淋巴、中腸及馬氏管呈現下調趨勢(圖3C)。

圖1 AMP17經顯微注射白色念珠菌誘導后家蠅幼蟲中的表達差異Fig.1 Variation in expression of AMP17 gene in Musca domestica larvae after microinjected Candida albicans

圖2 家蠅幼蟲不同組織標本Fig.2 Different tissue specimens from Musca domestica arvae

圖3 AMP17經白色念珠菌誘導后家蠅幼蟲中不同組織的表達差異Fig.3 Variation in expression of AMP17 gene in Musca domestica larvae after Candida albicans induction

3 討論

基因表達是指基因指導下的蛋白質合成過程，是調控生命活動的重要機制，不同發育階段、不同生理狀態下基因的表達決定了整個生命過程包括發育和分化、內環境穩定、對逆環境的反應等，因此比較不同發育階段、不同生理狀態下的基因表達情況可為分析不同生命活動過程提供重要信息[22]。當受到病原體或環境因素脅迫時，昆蟲機體會做出快速有效的免疫應答?？咕氖抢ハx體液免疫的重要效應分子，在受到感染和損傷時，昆蟲的抗菌肽能夠迅速合成,在信號肽酶的作用下成為有活性的物質，參與機體免疫應答[23]。

本研究中，經白色念珠菌脅迫后，AMP17基因的表達量隨時間的推移呈現先升高后降低再升高的狀態?？赡茉诜磻跗?AMP17基因的表達量應激性增高， 抗菌肽迅速合成，作為主要效應分子參與免疫應答,抵御損傷和病原體；之后，可能由于其他防御物質表達增加，或一些抑制因子的表達，使得機體對AMP17的需求減少以維持機體免疫穩態，以至在誘導后 24～36 h 有一個降低的過程[24];隨著時間的延長，存活的白色念珠菌數量不斷增長，48 h AMP17出現上調最高峰，可能是由于機體被大量真菌攻擊后，激活了體內的信號通路，誘導產生更多抗菌肽以應對病原體的侵害，提示AMP17基因參與了家蠅先天免疫的后期調節[25]。昆蟲對外來微生物的抵御是多免疫因子和多免疫組織共同協作的過程[26，27]。本研究還發現受到白色念珠菌脅迫后，AMP17 基因在不同家蠅組織相對表達水平隨時間的變化也有不同，說明不同組織對白色念珠菌有不同的防御機制。體壁是昆蟲直接接觸外界環境的重要組織，是保護機體免受外界各種刺激和損傷的第一道防線，它不僅是機體的物理屏障，同時也作為免疫器官發揮作用，相關研究指出，當機體受到微生物侵染時，昆蟲幼蟲的體壁能夠啟動免疫應答應對挑戰[28，29]。顯微注射白色念珠菌3 h、12 h、48 h后，體壁呈現高表達，推測是針刺感染的過程中的應激反應，體壁損傷后，激活機體免疫系統，產生大量的免疫相關因子，從而達到防御外源病原體的入侵并修復損傷的目的[30]。血淋巴及脂肪體為昆蟲的主要免疫器官，參與昆蟲的免疫應答反應[31，32]。本次研究中，血淋巴、脂肪體及唾液腺在白色念珠菌誘導后，表達水平相對較低，但將誘導12 h較3 h的相對表達水平相比較，都有上升趨勢，且脂肪體及唾液腺在誘導48 h時達到高峰，與不同時間點誘導結果相符。

綜上所述，AMP17基因參與了家蠅免疫應答反應，是家蠅免疫應答的關鍵分子之一，在家蠅先天免疫中扮演著重要的角色。本研究結果有利于深入理解家蠅乃至其他昆蟲抵御真菌侵染的防御機制，為進一步探討家蠅先天免疫系統提供新的思路。