香葉木素降低NLRP3炎性小體活性緩解CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化①

崔東娟 劉 濤 趙艷紅

(商丘醫學高等?？茖W校，基礎醫學部解剖學教研室，商丘 476000)

肝纖維化是病毒性肝炎、藥物性肝損傷、脂肪肝等多種慢性肝病的共同病理過程，是指在各種致病因素的作用下，肝臟發生損傷及炎性反應，造成肝細胞壞死和凋亡，細胞外基質分泌增加，使細胞外基質的生產與溶解之間失去平衡，導致過多的細胞外基質在肝內沉積而引發的一系列病理改變，可發展為肝硬化甚至肝腫瘤[1]。肝纖維化的發病率和死亡率都很高，且呈現逐年上升的趨勢，已成為一個亟待解決的醫學問題[2,3]。有效抑制肝纖維化的發生和發展對肝病的治療具有重要意義。越來越多的研究表明植物提取物在各類疾病的治療中具有積極作用，黃酮類化合物是水果、蔬菜、茶葉和可可中主要的活性植物成分之一，在肝保護、過敏反應和病毒感染等方面發揮著重要作用。香葉木素是黃酮苷香葉木甙的糖苷配基，發現于金合歡和橄欖葉中，具有多種藥理學活性，如抗癌、抗菌、抗氧化及抗炎等[4]。但關于香葉木素在肝纖維化中的作用研究還比較匱乏。本研究主要目的是探究香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 7周齡SD大鼠購自中國科學院實驗動物中心。CCl4購自國藥集團化學試劑有限公司。香葉木素(HPLC≥98%)、蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色液和改良型Masson 三色染色液購自Solarbio公司。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司?？辜毎鲋澈丝乖?67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki-67)抗體、抗含pyrin結構域NOD 樣受體家族3 (NOD-like receptor family， pyrin domain containing 3，NLRP3)抗體、抗凋亡相關微粒蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗體、抗Caspase 1抗體和抗白細胞介素(Interleukin，IL)-1β抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及藥物處理 香葉木素用DMSO溶解配制成1 mg/ml的溶液待用。實驗大鼠隨機分為4組：對照組；香葉木素(DM)組；CCl4組；CCl4+ DM組。首先CCl4組和CCl4+ DM組皮下注射40%的CCl4橄欖油溶液(1.5 ml/kg)，2周一次連續8周，對照組和DM組皮下注射等量的橄欖油。上述處理的倒數第6天開始，DM組和CCl4+ DM組每天腹腔注射香葉木素(20 mg/kg)，對照組和CCl4組用生理鹽水代替。

1.2.2HE染色 首先將肝臟左葉用4%的多聚甲醛于4°C下固定24 h。PBS清洗3次后用30%、50%和70%的酒精梯度脫水，每個梯度脫水10 min。去除酒精后，組織塊于脫水機中脫水，然后進行石蠟包埋和切片。最后按照HE染色液說明書進行HE染色。光鏡下觀察肝臟組織病變情況。

1.2.3免疫組化染色 各組大鼠肝臟組織的石蠟切片經脫蠟再水化后，用1%的Triton-100通透15 min，再用3%的H2O2處理15 min。經5%的羊血清封閉30 min后再加入抗Ki67抗體(0.5 μg/ml)，4℃過夜孵育，第二天加入二抗，于37℃孵育30 min。最后進行染色封片觀察。

1.2.4TUNEL 按照試劑盒說明書首先對石蠟切片進行預處理，石蠟切片依次進行二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，再用蛋白酶K于20～37℃處理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，隨后PBS清洗3次。然后進行生物素標記，顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，細胞核呈棕色顆粒的為凋亡細胞。

1.2.5Masson染色 石蠟切片常規脫蠟至水后，按照改良型Masson 三色染色液說明書進行染色。首先切片放入Bouin 液于37℃的溫箱內進行媒染2 h，水沖洗至切片上的黃色消失。然后進行天青石藍染色液滴染，Mayer 蘇木素染色液滴染，酸性乙醇分化，麗春紅品紅染色液滴染。最后蒸餾水稍漂洗后磷鉬酸溶液處理約10 min后于苯胺藍染色液染色5 min，弱酸溶液處理后乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察拍照，膠原纖維呈藍色，肌纖維、胞質、纖維素、角蛋白和紅細胞呈紅色，胞核呈藍褐色。

1.2.6蛋白印跡 首先用PBS將待測肝臟組織細胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液進行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后取等量(30 μg)蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應的一抗：抗NLRP3抗體(1 μg/ml)，抗ASC抗體(1 μg/ml)，抗Caspase 1抗體(12 μg/ml)，抗IL-1β抗體(0.2 μg/ml)，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液置于凝膠成像儀中，進行曝光拍照，統計灰度值后計算相對表達量。

1.3統計學分析 用SPSS16.0軟件進行統計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響 利用HE染色觀察香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響。如圖1所示，對照組和DM組肝臟組織細胞排列規則有序，無充血及壞死等病理學變化。CCl4組出現肝臟組織細胞排列紊亂無序、充血、細胞質空泡化、肝細胞壞死等病理變化。CCl4+DM組沒有觀察到明顯的肝臟組織病變。由此可見，香葉木素可減輕CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織病變。

2.2香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞增殖的影響 通過免疫組化染色檢測肝臟組織中增殖相關蛋白Ki67的表達，分析香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞增殖的影響。圖2顯示，CCl4組Ki67的表達明顯低于對照組(P<0.05)。CCl4+DM組Ki67的表達明顯高于CCl4組(P<0.05)。以上結果說明，香葉木素可增強CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞增殖。

2.3香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞凋亡的影響 利用TUNEL染色分析香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞凋亡的影響。由圖3可知，CCl4組細胞凋亡明顯高于對照組(P<0.05)。與CCl4組相比，CCl4+DM組細胞凋亡明顯下降P<0.05)。上述結果表明，香葉木素可減弱CCl4誘導的肝損傷大鼠細胞凋亡。

2.4香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化的影響 通過Masson三色染色分析香葉木素對Cl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化的影響。如圖4所示，對照組和DM組未見明顯的肝纖維化現象，CCl4組肝纖維化程度十分嚴重，CCl4+DM組肝纖維化現象得到明顯改善。以上結果說明，香葉木素可緩解CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化。

圖1 HE染色觀察肝臟組織病變(×200)Fig.1 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining (×200)

圖2 免疫組化染色檢測Ki67表達Fig.2 Expression of Ki67 was detected by immunohisto-chemical staining

圖3 TUNEL檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was measured by TUNEL

圖4 Masson染色觀察肝纖維化(×200)Fig.4 Hepatic fibrosis was observed by masson staining (×200)

圖5 蛋白印跡檢測NLRP3炎性小體相關蛋白表達Fig.5 Expression of NLRP3 inflammasome related protein was detected by Western blot

2.5香葉木素對CCl4誘導的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體相關蛋白表達的影響 為探究香葉木素可改善CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化的分子機制，蛋白印跡檢測NLRP3炎性小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1(活化型)和IL-1β的表達。圖5顯示，CCl4組NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β的表達明顯高于對照組(P<0.05)。與CCl4組相比，CCl4+DM組NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表達明顯下降(P<0.05)。由此可見，香葉木素可降低CCl4誘導的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體信號通路活化。

3 討論

目前治療肝纖維化的主要策略包括：減少原發性疾病、抑制肝細胞凋亡、減弱炎癥反應[5,6]。前人研究表明類固醇物質、膽烷酸、內源性大麻素等物質有利于肝纖維化的治療，但還存在耐藥性強、效果不顯著等缺陷，因此，迫切需要開發新藥來治療肝纖維化[7]。越來越多的文獻報道植物提取物在抗纖維化方面發揮著積極作用[8,9]。

各種肝病中常常會出現肝臟組織病變，據報道許多植物提取物具有改善肝臟組織病變的功效。有數據顯示香茅草提取物可改善H2O2誘導的大鼠肝臟組織充血、浸潤、細胞質空泡化和肝細胞變性等病變[10]。有研究表明沒食子酸、黃連素和波棱瓜提取物均可減輕CCl4誘導的小鼠肝臟組織脂肪變性，胞質空泡化及肝細胞壞死等病變現象[11-13]。另外，大蒜素可減輕CCl4誘導的大鼠肝臟組織病變[14]。本研究結果顯示，香葉木素可改善CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織細胞排列不規則、充血、細胞質空泡化、肝細胞壞死等病理變化。

肝細胞凋亡的增加是肝纖維化進程中的常見癥狀[15]。大量文獻報道植物提取物可調控細胞凋亡。有研究表明沒食子酸具有減弱CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織細胞凋亡的功能[16]。有數據顯示香葉木素可抑制缺血再灌注誘導的急性腎損傷小鼠腎臟細胞凋亡的上升[17]。在阿霉素誘導的視網膜損傷大鼠中，香葉木素可減弱視網膜組織細胞凋亡的增強[18]。Yang等[19]發現香葉木素還可降低內毒素誘導的急性肝衰竭小鼠肝臟組織細胞凋亡的增加。本文結果顯示，香葉木素可增強CCl4誘導的肝損傷大鼠肝臟組織Ki67表達，降低細胞凋亡。

越來越多的研究表明多種植物提取物具有緩解肝纖維化的作用。據報道在高脂飲食誘導的肥胖小鼠中，桑葉提取物可降低肝纖維化[20]。有研究發現食用辣椒素可抑制膽管結扎或CCl4誘導的小鼠肝纖維化[21]。有數據顯示滿天星異葒草苷和蝦仔花提取物都具有減輕CCl4誘導的大鼠肝纖維化的功效[22，23]。本研究結果顯示，香葉木素可緩解CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化。

NLRP3炎性小體在各類疾病中具有重要作用，NLRP3炎性小體的活化會導致肝纖維化的加劇[24-26]。研究表明許多植物提取物可調節NLRP3炎性小體活性。Wang等[27]發現在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠中，槐耳提取物可降低NLRP3炎性小體活性發揮保護作用。有數據顯示菊苣提取物可通過抑制NLRP3炎性小體活性起到抗糖尿病的功效[28]。據報道野風仙花提取物可抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠NLRP3表達的上升，降低NLRP3炎性小體活性[29]。另外，香葉木素也可抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠NLRP3和ASC表達的升高，抑制NLRP3炎性小體活性[30]。本文結果顯示，香葉木素可減弱CCl4誘導的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體信號通路活化。

綜上所述，在CCl4誘導的肝損傷大鼠中，香葉木素可減輕肝臟組織病變，增強細胞增殖，降低細胞凋亡，改善肝纖維化，減弱NLRP3炎性小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表達。香葉木素可通過抑制NLRP3炎性小體信號通路緩解CCl4誘導的肝損傷大鼠肝纖維化。下一步將計劃研究香葉木素對其他因素導致的肝纖維化的影響。