不同級別蛹蟲草子實體菌粉對免疫低下小鼠非特異性免疫功能的調節作用比較

馬淑梅，陳 瑤，顏仁杰，王佳慧，劉 莉

(1. 中國醫藥工業研究總院藥理評價研究中心，2. 上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺，3. 上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437)

蛹蟲草俗稱北蟲草，主要含有蟲草素、蟲草多糖、蟲草酸等物質，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、治療腎損傷、增強機體免疫力、降血糖等功效[1-4]。Cunningham等[5]首次從蛹蟲草中提取到蟲草素，并確定其結構為3-脫氧腺苷。研究表明，蟲草素能夠促進淋巴細胞分泌干擾素-γ，激活自然殺傷細胞和巨噬細胞，增強其殺傷吞噬活性，從而提高機體非特異性免疫功能[6]。

蛹蟲草提取精制過程中，提取溫度和提取次數均會影響蟲草素的得率。因此，本研究中將不同人工培植方法得到的兩種蟲草子實體——超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草，直接經粉碎機制備成蟲草子實體菌粉，經HPLC(NYT/2116-2012)分析測試發現，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實體菌粉的蟲草素含量分別為1.07×104mg·kg-1和1.41×103mg·kg-1，超Ⅴ星蟲草子實體菌粉中蟲草素的含量為Ⅰ星蟲草含量的7.6倍。本文通過檢測免疫低下小鼠的巨噬細胞吞噬、自然殺傷細胞殺傷活性、細胞因子分泌水平等，分析比較了超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實體菌粉對機體非特異性免疫功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與細胞株SPF級♂BALB/c小鼠50只，體質量(18～20) g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016。小鼠淋巴瘤細胞YAC-1，由本實驗室傳代保存。

1.2藥物與試劑蛹蟲草子實體-超Ⅴ星(批號S160321P-0，深褐色粉末)、蛹蟲草子實體菌粉-Ⅰ星(批號S170603，淺黃色粉末)，均由常德炎帝生物工程有限公司提供；蛹蟲草菌粉膠囊(吉林省中晟制藥有限公司，批號20160101)；地塞米松磷酸鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司，批號1705252111)。刀豆球蛋白A(ConA，Sigma，批號SLBM9735V)；脂多糖(LPS，Sigma，批號011M4001V)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20180113)；小鼠白介素2(interleukin 2，IL-2)ELISA試劑盒(批號K25031872)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(批號Q15031805)，均購自武漢華美生物工程有限公司；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(上海酶聯，批號01/2018)。

1.3儀器Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀、Legend Micro 21R離心機、370 Series二氧化碳培養箱(Thermo Scientific公司)；GI54DWS(50L)全自動高壓滅菌鍋(Zealway公司)；5810R高速離心機(Eppendorf公司)；NIB-100普通倒置顯微鏡(寧波永新光學股份有限公司)。

1.4模型的制備及分組給藥50只BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、超Ⅴ星蟲草(1 g·kg-1)組、Ⅰ星蟲草(1 g·kg-1)組和蟲草膠囊(陽性藥，1 g·kg-1)組。動物分組后，持續給藥28 d，給藥體積為10 mL·kg-1體質量，對照組和模型組灌胃給予等體積的飲用水。除對照組外，其余各組于實驗d 22、23腹腔注射地塞米松20 mg·kg-1，期間每周稱量動物體質量。末次給藥后24 h稱重，以各組解剖當日體質量減去地塞米松造模前體質量計算體質量變化值；取血，測血常規；頸椎脫臼處死動物后解剖，取胸腺、脾臟稱重，計算胸腺指數和脾臟指數。

1.5巨噬細胞吞噬中性紅實驗用DMEM完全培養液將腹腔巨噬細胞調節至1×109·L-1，接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 h。棄上清，每孔加DMEM完全培養液100 μL，再加1 g·L-1的中性紅水溶液100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 h。棄上清，用PBS沖洗3次，加細胞裂解液過夜，酶標儀于540 nm波長下測OD值。

1.6自然殺傷(naturalkiller，NK)細胞殺傷活性測定用含5 g·L-1牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)的RPMI 1640完全培養液，將脾淋巴細胞調至2.5×1010·L-1作為效應細胞，用含5 g·L-1BSA的RPMI 1640培養液將YAC-1細胞調節至5×108·L-1作為靶細胞；向96孔板中分別加入100 μL效應細胞和靶細胞(效應細胞：靶細胞=50 ∶1)懸液，自然釋放孔加100 μL的靶細胞和100 μL含5 g·L-1BSA的RPMI 1640培養液，最大釋放孔加100 μL的靶細胞和100 μL 0.2%的NP-40裂解液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h；低溫離心取上清；按照LDH測定試劑盒說明書測定細胞上清液的LDH活性。

NK細胞殺傷活力=(實驗孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100%

1.7脾淋巴細胞分泌IL-2水平檢測用RPMI 1640完全培養液將脾淋巴細胞調節至1×109·L-1，取24孔培養板，每孔加入0.5 mL含ConA(終濃度5 mg·L-1)的小鼠脾淋巴細胞懸液，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，離心取上清，用ELISA法測定上清中IL-2的含量。

1.8腹腔巨噬細胞分泌TNF-α及IL-6水平的檢測用DMEM完全培養液將腹腔巨噬細胞調節至1×109·L-1，在24孔培養板中，每孔加入0.5 mL小鼠腹腔巨噬細胞懸液，2 h后棄上清，每孔加入0.5 mL含LPS(終濃度10 mg·L-1)的培養液，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，取上清，用ELISA法測定上清中TNF-α、IL-6的含量。

2 結果

2.1超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實體菌粉對免疫低下小鼠體質量變化的影響Tab 1結果顯示，d 22造模后，各組小鼠體質量均降低，模型組小鼠體質量明顯下降，毛色無華，精神萎靡。與模型組比較，Ⅰ星蟲草、超Ⅴ星蟲草與蟲草膠囊均可明顯拮抗地塞米松造成的體質量下降，Ⅰ星蟲草和超Ⅴ星蟲草比較差異無顯著性。但在體質量恢復的趨勢上，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

2.2超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實體菌粉對免疫低下小鼠免疫器官指數的影響胸腺和脾臟都是機體質量要的免疫器官，前者是T細胞分化、發育、成熟的場所，后者是機體細胞免疫和體液免疫的中心，兩者的臟器指數可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。由Tab 1可見，采用地塞米松造模后，模型小鼠胸腺指數和脾臟指數明顯下降，與模型組相比，Ⅰ星蟲草、超Ⅴ星蟲草與蟲草膠囊均明顯拮抗地塞米松造成的胸腺指數和脾臟指數下降。在拮抗由地塞米松所導致的胸腺指數下降方面，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，但在胸腺指數恢復的趨勢上，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。在拮抗由地塞米松所導致的脾臟指數下降方面，超Ⅴ星蟲草明顯強于Ⅰ星蟲草。

2.3超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草子實體菌粉對免疫低下小鼠血常規指標的影響如Fig 1所示，采用地塞米松造模后，模型小鼠白細胞計數明顯降低，中性粒細胞百分率明顯升高，淋巴細胞百分率明顯降低。超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗由地塞米松所導致的中性粒細胞百分率升高，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性；超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗由地塞米松所導致的淋巴細胞百分率降低，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比有顯著性差異。

2.4超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬活性的影響由Fig 2可知，用地塞米松造模的小鼠巨噬細胞吞噬能力明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗該變化，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，但增強巨噬細胞吞噬活性的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。超Ⅴ星蟲草、Ⅰ星蟲草與蟲草膠囊比較差異均無顯著性。

Tab 1 Effect of different levels of Cordyceps militaris powder on weight change and visceral index of dexamethasone induced immunodeficiency

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsdexamethasone；△P<0.05vsⅠ star CM；▲P<0.05vscordyceps capsule

Fig 1 Effects of different levels of Cordyceps militaris on blood routine in mice after 28 days of

A:White blood cell(WBC) count. B:Percentage of neutrophilic granulocytes(NE%), C:Percentage of lymphocytes (LY%),1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM;▲▲P<0.01vscordyceps capsule.

Fig 2 Effects of different levels of Cordyceps militaris on phagocytic activity of mice abdominal macrophages after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdexamethasone

2.5超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠NK細胞活性的影響由Fig 3可知，用地塞米松造?？擅黠@降低NK細胞活性，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、蟲草膠囊均可明顯拮抗該變化，且超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草相比具有顯著性差異。

2.6超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠淋巴細胞分泌細胞因子的影響本實驗選擇測定IL-2水平，來觀察不同級別蟲草子實體菌粉對免疫低下小鼠T淋巴細分泌細胞因子的影響。Fig 4結果顯示，與正常對照組相比，給予地塞米松后，IL-2的生成量明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、蟲草膠囊都可以明顯拮抗地塞米松引起的IL-2分泌降低，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草相比差異無顯著性，趨勢上超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

Fig 3 Effect of different levels of Cordyceps militaris on NK cell killing activity in mice after 28 days of

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM;▲▲P<0.01vscordyceps capsule

2.7超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對免疫低下小鼠巨噬細胞分泌細胞因子的影響本實驗選擇測定TNF-α和IL-6，觀察不同級別蟲草子實體菌粉對巨噬細胞分泌細胞因子的影響。由Fig 5可知，與正常對照組相比，給予地塞米松后，TNF-α和IL-6分泌量均明顯降低，而超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草、陽性藥都可以拮抗地塞米松引起的TNF-α和IL-6分泌量降低；在拮抗地塞米松誘導的TNF-α分泌量降低方面，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草相比具有顯著性差異。

Fig 4 Effect of different levels of Cordyceps militaris on IL-2 level secreted by mouse spleen lymphocytes after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone

Fig 5 Effects of different levels of Cordyceps militaris on TNF-α secretion and IL-6 secretion of mice abdominal macrophages after

1: Control; 2: Dexamethasone; 3: Ⅰ star CM; 4: Super Ⅴ CM; 5: Cordyceps capsule.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsdexamethasone;△P<0.05vsI star CM

3 討論

本實驗從體質量、臟器指數、血常規、巨噬細胞功能測定、NK細胞活性和細胞因子分泌等多個方面，對超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草的免疫調節功效進行了比較。對于體質量，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草均可明顯拮抗地塞米松造成的體質量降低，Ⅰ星蟲草和超Ⅴ星蟲草比較差異無顯著。但體質量恢復的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。對于血常規，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗地塞米松導致的白細胞計數和淋巴細胞降低，以及中性粒細胞升高，對地塞米松造成的淋巴細胞百分率降低的拮抗作用，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草比較具有顯著性差異。

影響非特異性免疫功能的研究方法較多，免疫藥理實驗常以藥物對實驗動物免疫器官重量的影響，作為初步觀察藥物對免疫功能影響的指標，當機體的整體免疫功能增強時，其質量有所增加，臟器系數增加[7-8]。對于臟器指數，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草均明顯拮抗地塞米松造成的胸腺指數和脾臟指數下降，對地塞米松造成的胸腺指數下降的拮抗作用，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草比較差異無顯著，但胸腺指數恢復的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。對地塞米松造成的脾臟指數下降的拮抗作用，超Ⅴ星蟲草明顯強于Ⅰ星蟲草。

在機體內，巨噬細胞是其免疫系統的一種重要免疫細胞，具有很強的吞噬功能及抗原遞呈作用，對特異性免疫應答的誘導和調節起關鍵作用。巨噬細胞通過釋放NO、IL-6、TNF-α等細胞因子，誘導細胞免疫，殺滅病原微生物[9-10]。巨噬細胞吞噬力的高低，反映了機體免疫水平的高低。巨噬細胞活性強、吞噬力高，機體的免疫力就高。對于單核-巨噬細胞功能，腹腔巨噬細胞吞噬中性紅實驗中，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯拮抗地塞米松造成的小鼠巨噬細胞吞噬能力的降低，超Ⅴ星蟲與Ⅰ星蟲草比較差異無顯著，但增強巨噬細胞吞噬活性的趨勢方面，超Ⅴ星蟲草略好于Ⅰ星蟲草。

NK細胞是生物體內天然存在的非特異的免疫殺傷細胞。NK細胞對T細胞、B細胞、骨髓干細胞等細胞的功能均有一定的調節作用，還能夠分泌多種細胞因子，它在宿主的免疫監視功能中起重要作用。對于NK細胞活性，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草可明顯增加NK細胞活性，超Ⅴ星蟲草與Ⅰ星蟲草比較具有顯著性差異。

綜上所述，超Ⅴ星蟲草和Ⅰ星蟲草對地塞米松誘導的免疫功能低下的各個環節均具有明顯的改善作用，在提高脾臟指數、增強NK細胞殺傷能力、提高巨噬細胞分泌TNF-α分泌水平方面，超Ⅴ星蟲草作用明顯優于Ⅰ星蟲草。