二氟甲基鳥氨酸對2型糖尿病大鼠心肌肥厚及內質網應激的影響

林 巖，王 珺，肖 薇，李 波，金 莉，廉 潔，于 水

(齊齊哈爾醫學院1.病理生理學教研室、2.組織學與胚胎學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006 )

糖尿病心肌病(diabetic cardiomypathy，DCM)為2型糖尿病(type 2 diabetic melitus，T2DM)患者常見的心臟并發癥，主要病理表現為微血管病變導致的心肌肥大、局灶性心肌壞死、心肌纖維化，易并發心力衰竭及心律失常，是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1-2]。近年來發現，糖尿病患者高血糖狀態、心肌細胞內質網功能紊亂，均可引發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，ERS在DCM發生、發展中發揮重要作用[3]。

多胺包括腐胺、精脒和精胺，是廣泛存在于生物體各種組織細胞內的小分子脂肪族化合物。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成途徑中的關鍵限速酶。二氟甲基鳥氨酸(DL-α-difluoromethylornithine，DFMO)同鳥氨酸的結構類似，被公認為最有效的ODC特異性抑制劑，可作為ODC的底物進行脫羧反應，導致ODC發生不可逆的結構改變，降低細胞內多胺含量[4]。前期研究發現，DFMO通過抑制ERS，具有抑制心肌肥大及心肌細胞凋亡的作用[5-6]，但是其對T2DM引發的心肌肥厚及ERS的影響尚不清楚。本實驗以T2DM大鼠為研究對象，探討DFMO對T2DM大鼠心肌肥厚的影響，并從ERS角度探討其機制。

1 材料

1.1實驗動物Wistar大鼠，♂，SPF級，體質量(200～250) g。由齊齊哈爾醫學院動物研究所提供，動物合格證編號:SYXK( 黑) 2008004。

1.2藥物與試劑高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇、1%膽鹽和66.5%基礎飼料)，北京科澳協力飼料有限公司提供；鏈脲佐菌素(steptozotocin，STZ)、DFMO，均購自美國Sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器光學顯微鏡、病理切片機(德國徠卡公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；血糖儀(美國強生公司)；電泳儀、電泳槽(上海天能科技有限公司)電泳成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1實驗動物分組與處理實驗動物分籠飼養，自由進食、飲水，12 h晝夜交替人工照明。將大鼠隨機分為正常對照組10只、模型組40只。對照組大鼠給予普通飼料飼養，模型組大鼠給予高脂飼料喂養4周，4周后禁食不禁水，一次性腹腔注射STZ 55 mg·kg-1(溶于0.1 mmol·L-1檸檬酸緩沖液中，pH 4.4，冰浴，現配現用，5 min內用完)，72 h后尾靜脈采血測量血糖濃度，血糖≥16.7 mmol·L-1為T2DM大鼠造模成功，正常對照組大鼠單次腹腔注射相同劑量的枸櫞酸緩沖液。將成模的T2DM大鼠隨機分為2組，模型組12只、治療組14只，治療組進行DFMO干預，T2DM大鼠給予2% DFMO水溶液連續飲用12周。實驗過程中，除正常對照組外，其余各組大鼠均給予高糖高脂飼料。

2.2取材干預治療12周后，大鼠禁食10 h，取大鼠尾靜脈血測定血糖。處死前，稱量大鼠體質量(body weight, BW)，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，迅速開胸取出心臟，剪去心臟周圍組織和血管，濾紙吸干后，稱全心重(heart weight, HW)，沿室間隔剪去右心室組織，稱量左室重(left ventricular weight，LVW)。計算心臟參數HW/BW和LVW/BW。4%多聚甲醛固定心肌組織，石蠟包埋，常規HE染色，光鏡下觀察心肌細胞及心肌間質的變化，將心肌組織置于液氮中保存備用。

2.3生化指標檢測各組大鼠取左心室組織，勻漿后，嚴格按照試劑盒說明書操作，分別測定MDA含量、SOD和T-AOC活性。

2.4Masson染色石蠟切片脫蠟至水，自來水和蒸餾水沖洗，蘇木精染液染核5～10 min，充分水洗后，用Masson麗春紅酸性復紅液染色5～10 min，浸洗分化后，苯胺藍液染5 min，二甲苯透明、中性樹膠封固。膠原纖維被苯胺藍所染呈藍色，肌纖維被麗春紅所染呈紅色。

2.5Westernblot檢測各組取心肌組織約50 mg，裂解液充分作用，4 ℃離心后取上清液，Bradford法測定蛋白質濃度后，蛋白定量，蛋白變性。各組蛋白上樣量為30 μg，SDS-PAGE電泳，蛋白轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后，分別加入一抗GRP78、CHOP、β-actin(1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，相應二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h。ECL化學發光顯色，電泳成像系統定量掃描分析，結果以β-actin校正。

3 結果

3.1DFMO對T2DM大鼠空腹血糖和心臟參數的影響心臟參數HW/BW和LVW/BW能夠反映大鼠的心肌肥厚程度。Tab 1結果表明，與對照組比較，T2DM組大鼠空腹血糖及心臟參數HW/BW、LVW/BW均增高，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，治療組大鼠空腹血糖和心臟參數HW/BW、LVW/BW均低于糖尿病組(P<0.05)。

Tab 1 Effect of DFMO on blood glucose and index of cardiac hypertrophy in type 2 diabetic

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsT2DM

3.2DFMO對MDA、SOD和T-AOC的影響Tab 2結果顯示，T2DM模型組大鼠與對照組比較，心肌組織MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD活性和T-AOC明顯下降(P<0.01)；與T2DM模型組比較，DFMO治療組MDA含量明顯下降(P<0.01)，SOD和T-AOC活性升高(P<0.05，P<0.01) 。

Tab 2 Effect of DFMO on content of MDA, activities of SOD and T-AOC of myocardial tissues in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsT2DM

3.3DFMO對心肌間質纖維化的影響Masson染色是經典膠原纖維染色方法，染色后膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。Fig 1結果表明，正常對照組心肌細胞間隙清晰可見，間質膠原纖維極少。與對照組相比，T2DM組大鼠心肌細胞間質和血管旁有較多明顯藍色深染；治療組與T2DM組比較，心肌細胞間質和血管旁的藍色深染逐漸減少，膠原沉積逐漸減輕，表明DFMO可以一定程度抑制T2DM大鼠心肌膠原纖維的沉積。

3.4DFMO對心肌組織GRP78和CHOP蛋白表達的影響如Fig 2所示，T2DM組與對照組比較，GRP78和CHOP蛋白表達量明顯增加(P<0.01)；DFMO治療組與T2DM組比較，GRP78和CHOP蛋白表達量明顯下降(P<0.01)。

4 討論

DCM是由高血糖、心肌代謝紊亂引起的心肌細胞原發性損傷，是T2DM患者常見并發癥，典型表現為心臟微血管病變及心肌纖維化，最終引發左心室肥厚，心肌功能障礙及心力衰竭。DCM發病機制復雜，氧化應激、炎癥、心肌細胞凋亡、糖脂代謝紊亂、線粒體損傷、心肌纖維化，都被認為是DCM發生、發展的機制[7-8]，目前臨床對DCM尚缺乏有效的治療措施。

Fig 1 Masson staining of myocardium in rats(×400)

Fig 2 Effect of DFMO on protein expression of GRP78 and

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsT2DM group

多胺生理作用廣泛，能與細胞內核酸、蛋白質等生物大分子相互作用，從而影響和調節細胞生理功能。DFMO為多胺合成代謝限速酶的特異性抑制劑，通過抑制鳥氨酸脫羧酶活性，明顯降低細胞內多胺水平，從而減弱胃腸道組織、心肌組織等增生反應。前期研究表明，DFMO通過抑制鳥氨酸脫羧酶活性，減少細胞內多胺含量，對老年性心肌病、心肌肥厚、心肌缺血/再灌注損傷等具有保護作用，但對糖尿病引起的心肌肥大尚無明確報道。本研究動物實驗顯示，DFMO能夠明顯降低T2DM大鼠空腹血糖和心臟參數，改善T2DM大鼠的心肌肥厚。

高糖血癥和胰島素抵抗是T2DM的主要特征，二者均使葡萄糖和脂肪酸的氧化作用增加，而引起氧化應激反應，線粒體內部活性氧大量聚集，進一步加重T2DM患者的代謝紊亂，導致惡性循環[9]。生化指標檢測發現，DFMO干預后，心肌組織MDA含量明顯降低，SOD活性和T-AOC明顯升高，提示DFMO可通過抑制心肌脂質過氧化物生成，增強總抗氧化能力，減輕氧化應激損傷，進而對T2DM發揮保護作用。

氧化應激、缺氧、脂質積聚等病理刺激都會影響內質網的正常生理功能，引起未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網的聚集，從而引發ERS[10]。ERS通過上調GRP78的表達，有助于蛋白質折疊修復，但若ERS長時間持續，通過促進CHOP的轉錄誘導，啟動細胞凋亡過程[11-12]。本研究中，T2DM大鼠心肌組織GRP78和CHOP表達水平增加，DFMO治療組GRP78和CHOP蛋白表達水平降低，提示ERS參與了T2DM的發生、發展，表明DFMO對T2DM的心肌保護作用與ERS具有相關性。

綜上所述，本實驗結果初步顯示，DFMO可降低大鼠心肌組織GRP78和CHOP蛋白表達，該結果可能與其心肌保護作用有關。

(致謝：感謝齊齊哈爾醫學院基礎醫學院分子生物學研究室為本課題研究提供儀器設備和技術支持。)