徐洪勝,彭振宇
(浙江莎普愛思藥業股份有限公司,浙江 平湖 314200)
儀器:Agilent 1200 series高效液相色譜儀,DAD檢測器
蛇床子素對照品,購于中國食品藥品檢定研究院(批號:110822-201609,供含量測定用,純度99.6%)。乙腈為色譜純,水為超純水,其它試劑均為分析純。
色譜柱:Sepax Bio-C18(4.6×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(50:50);流速:0.9 ml/min;柱溫:40℃;檢測波長:322 nm;理論板數按蛇床子素峰計算應不低于5000。
精密稱取蛇床子對照品適量,加無水乙醇制成每1 mL含0.030 mg的溶液,即得。
取裝量差異項下的內容物,研細,取約0.3 g,精密稱定,精密加無水乙醇50 mL,稱定重量,超聲處理30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用無水乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,即得。
精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL,注入液相色譜儀,測定,計算,即得。
2.1.1 測定波長的選擇
精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL,注入液相色譜儀,觀察對照品溶液與供試品溶液210 nm~400 nm范圍內在線紫外光譜圖,蛇床子素在320 nm波長附近有最大吸收。參照中國藥典2015年版一部蛇床子項下含量測定方法,選擇322 nm為本實驗的測定波長。
2.1.2 流動相的選擇
參照《中國藥典》2015年版一部蛇床子項下含量測定方法,以Sepax Bio-C18(4.6×250 mm,5 μm)為色譜柱,采用乙腈-水(65:35)作為流動相,蛇床子素峰保留時間較快,調整流動相的比例至乙腈-水(50:50),結果分離效果較好,保留時間適度,因此,確定乙腈-水(50:50)為本法的流動相。
為進一步考察試驗的合理性,取不含蛇床子的陰性對照樣品、供試品、溶劑(無水乙醇)。依正文所述方法進行測定。結果,陰性樣品色譜在與蛇床子素峰相應的保留時間附近無干擾峰檢出,從而證明本方法是合理可行的。
精密稱取蛇床子素對照品適量,加甲醇制成每1 mL含0.03024 mg的溶液,分別精密吸取1、3、5、7、9、15 μL測定,以對照品進樣量為橫坐標,以峰面積和為縱坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程為y=2511.5056x-4.5053 R2=0.9999,見表1,結果表明蛇床子素在0.03024~0.45358 μg范圍內,進樣量與峰面積呈線性關系,符合外標法定量測定的要求。
表1 標準曲線數據
精密吸取供試品溶液5 μL,注入液相色譜儀,重復6次,測定其色譜峰面積值,見表2。
表2 精密度試驗結果
精密吸取供試品溶液5 μL,間隔以下時間,注入液相色譜儀,按正文色譜條件測定,見表3。
取同一供試品(批號130827)依正文方法獨立測定六次,見表4。
采取半量加樣回收法,精密稱取已知含量的供試品(含蛇床子素5.4933 mg/g)共6份,每份0.3 g,分別置具塞錐形瓶中,精密加入對照品溶液(含蛇床子素0.03888 mg/mL,未折純度)50 mL,依法測定回收率,見表5。
表3 穩定性試驗結果
表4 重復性試驗結果
表5 回收率試驗結果
依正文方法測定。
蛇床子現行標準為中國藥典2015年版一部,其中含量測定項規定,按干燥品計算,含蛇床子素不得少于1.0%;水分不得過13.0%,根據處方計算,理論值應不少于1.70 mg/粒??紤]到生產中的波動,原料藥材投料時未折水分,70%乙醇提取轉移率為50%,暫定本品每粒含蛇床子以蛇床子素(C13H18O7)計,不得少于0.80 mg/粒。