HPLC法測定蛇床子中蛇床子素的含量

林進生

（福建片仔癀化妝品有限公司，福建漳州，363000）

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床（Cnidiummon?nieri（L.）Cuss.）的干燥成熟果實。傳統中醫認為蛇床子味辛、苦，性溫，歸腎經，具有燥濕祛風、殺蟲止癢、溫腎壯陽的作用，常用于治療陽痿、濕痹腰痛、急性滲出性皮膚病等疾病?，F代分析表明，蛇床子所含的主要化學成分為香豆素、色原酮類、苯并呋喃類等化合物，其中最為關鍵的活性成分為蛇床子素［1-2］。

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚、歐芹酚甲醚，化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素［3］，屬于香豆素類化合物。蛇床子素廣泛存在于傘形科植物中，是植物中呋喃香豆素的代表性物質［4］。從大量研究表明，蛇床子素及其衍生物具有降血壓、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌［5-11］等多種生物活性，對心腦血管系統、內分泌系統、免疫系統、神經系統、呼吸系統等方面的疾病都有良好的治療效果。

本研究通過對蛇床子素高效液相色譜測定方法精密度、穩定性、重復性的考察，確定了適于蛇床子中蛇床子素測定的參數指標，并測定了不同蛇床子樣品中蛇床子的素含量，以期為蛇床子和蛇床子素的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛇床子（亳州市弘寶堂商貿有限公司）。

1.2 試劑儀器

蛇床子素對照品（分析標準品≥99.5%，阿拉丁科技有限公司）；甲醇（北京生化科技有限公司）；乙腈（北京生化科技有限公司）；乙醇（南京化學試劑有限公司）。

Waters E2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UTP-313型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?；KQ－210A型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；FSJ-A03D1小型粉碎機（小熊電器股份有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀器（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；SHB-IIIA循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

采用乙醇回流法提取蛇床子中蛇床子素。準確稱取100 g蛇床子藥材，放入小型粉碎機粉碎。圓底燒瓶中按料液比1：15加入30%乙醇進行熱回流提取，分兩次提取，每次提取時間為3 h。提取后溶液放置室溫后過濾，3500 r/min離心15 min離心后抽濾，得到上清液即為蛇床子提取液。將蛇床子提取液放入旋轉蒸發儀器減壓回收溶劑直至浸膏狀態，放入真空干燥箱烘干后得到蛇床子提取物。提取物中加入適量甲醇配置成供試樣品溶液，通過0.22μm有機膜過濾備用。

1.3.2 對照品溶液的制備

準確稱取蛇床子素對照品2.500 mg，加甲醇定容至25 mL棕色量瓶中，搖勻，制得質量濃度為0.1 mg/mL的對照品儲備液，4℃貯存備用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱選擇Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-體積分數0.05%磷酸（體積比70：30）。檢測波長為322 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10μL，柱溫為30℃。

2 結果與分析

2.1 色譜條件分析

按照色譜條件，將對稀釋為50μg/mL的對照品溶液和供試樣品溶液分別進樣分析，得圖譜如圖1-2所示。分析可知，在以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，甲醇-體積分數0.05%磷酸（體積比70：30）為流動相，流速為1.0 mL/min，進樣量為20μL，柱溫為30℃檢，測波長為322 nm的液相色譜條件下，蛇床子素具有明顯的特征性吸收峰，特征峰的出峰時間為8.355 min。供試樣品溶液中的蛇床子素在此色譜條件下，實現了其它物質的分離，特征峰明顯，出峰時間為8.398 min。表明該色譜條件適于蛇床子中蛇床子素的測定。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogramof reference substance

2.2 線性關系考察

將蛇床子素對照品儲備液稀釋成12.5、25、50、100、200μg/mL進樣液，分別進行進樣分析。以進樣液中蛇床子素的濃度為橫坐標，以特征峰的峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，并計算出蛇床子素的線 性 回 歸 方 程 為Y=4.172×104X+1.912×102，R2=0.999 6。結果表明，蛇床子素的濃度在12.5～200μg/mL范圍內，其峰面積與進樣液中蛇床子素濃度具有良好的線性關系。

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of test article

2.3 精密度考察

按照色譜條件，重復6次對供試樣品溶液進行進樣分析，并根據特征峰峰面積，通過回歸方程計算供試樣品中蛇床子素的平均含量為5.12±0.04%。對測定結果進行統計分析，計算出RSD為1.28%（n=6），小于3.0%，表明該方法的精密度良好。

2.4 穩定性考察

取蛇床子供試樣品品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進行進樣分析。通過蛇床子素的峰面積計算供試品中蛇床子素的含量，并對結果進行統計分析，計算測定結果的RSD為1.32%（n=7），小于3.0%，表明在本方法條件下，蛇床子供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4 重復性考察

取同一蛇床子樣品分成6份，分別按照試驗方法提取制成供試樣品溶液，按色譜條件分別進樣分析，計算測定結果，并對結果進行統計分析，計算出RSD為0.87%（n=6），小于3.0%，表明其重復性良好。

2.5 加樣回收率測定

分別精密吸取蛇床子素對照溶液2、2、3、3、4、4 mL，放置于20 mL容量瓶中，揮干。取6份已知含量的供試樣品溶液加入容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋至刻度，分別取20μL注入高效液相色譜儀器中，按照色譜條件進行分析，根據回歸方程計算蛇床子素含量，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 蛇床子素加樣回收率試驗結果Table 1 Test results of recovery of osthol

由表1分析可知，該方法平均加樣回收率為99.36%，加樣回收的RSD為1.53%，表明該方法測定蛇床子素含量具有良好的準確度。

2.6 樣品含量測定

取3批蛇床子藥材制成供試品溶液，按照色譜條件進行測定，根據回歸方程計算蛇床子素在蛇床子中的含量。結果見表2，所測樣品中蛇床子素含量分別為5.47%、5.56%和5.71%，同批次內樣品的蛇床子素含量測定值的RSD值分別為1.36%、1.52%、1.17%，表明研究所確定的測定方法對不同蛇床子樣品中蛇床子素的測定均有較高的準確度。

3 討論

蛇床子素作為植物中呋喃香豆素的代表性物質，大量研究表明其具有降血壓、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多種生物活性，對心腦血管系統、內分泌系統、免疫系統、神經系統、呼吸系統等方面的疾病都有良好的治療效果。尤其是近年來的研究表明，蛇床子素對癌癥、腦退化疾病都有較好療效，這對于醫學和社會都具有重大價值，隨著現代科學研究的不斷深入，蛇床子素將在臨床上展現出更廣闊的前景。

本研究通過對蛇床子素高效液相色譜測定方法精密度、穩定性、重復性的考察，確定了適于蛇床子中蛇床子素HPLC測定的條件為：以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，甲醇-體積分數0.05%磷酸（體積比70：30）為流動相，流速1.0 mL/min，進樣量20μL，柱溫30℃，檢測波長為322 nm。通過該方法測定不同蛇床子樣品中蛇床子素的平均含量為5.58%。