血清長鏈非編碼RNA LNC00993聯合MMP-2和CEA在食管癌診斷和預后中的研究

李筱，張靜，向慧敏

(漢中市中心醫院精準醫學診斷中心，陜西 漢中 723000)

隨著人們飲食習慣的改變，我國部分省市食管癌的發病率呈現出上升趨勢。早期食管癌癥狀不典型甚至無癥狀，患者不易察覺，當出現進行性吞咽困難或咽下食物時有胸痛的感覺等典型癥狀時，患者多已進展到中晚期[1]。目前，食管癌的主要篩查手段是食管脫落細胞學檢查，但由于其敏感性和特異性均較低、且具有一定的創傷性，無法在人群中推廣使用[2]。值得注意的是，盡管食管癌的診斷和治療已有較大進展，但其預后仍不盡如人意，這很大程度上是由于缺少可靠易行的早期篩查手段。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)與癌癥的發生、發展及轉移密切相關[3]。近年來，研究發現LNC00993在食管癌癌組織中存在異常表達，對食管癌癌具有潛在的診斷價值?；|金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是一類重要的水解細胞外基質的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長與轉移過程[4]。本研究通過比較食管癌患者與健康人群的LNC00993、MMP-2與癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平，旨在探究三者對食管癌的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集本院2015年1月到2016年12月確診的食管癌患者120例作為病例組，患者均為首次住院且經內鏡組織學檢查確診。其中上段食管癌19例，中段食管癌66例，下段食管癌35例；I-II期食管癌患者31例，III-IV期患者89例；鱗癌96例，腺癌13例，腺鱗癌11例；高分化癌31例，中分化癌66例，低分化癌23例。選取同期在本院行健康體檢的健康人群120例作為對照組。本研究的開展經醫院倫理委員會批準。從患者入院開始對納入的120例食管癌患者進行隨訪，隨訪日期截止至2018年7月，隨訪時間為18到42個月。本研究的開展經醫院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 臨床資料與樣本的采集

由研究人員記錄患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史等基本信息。使用促凝采血管收集經禁食10 h以上食管癌患者接受治療前和健康對照者入院體檢時的靜脈血5 mL。收集的標本在1 h內于4 ℃條件下以3 500 g離心力離心10 min，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存備檢測。

1.3 血清CEA與MMP-2水平的檢測

血清CEA的檢測采用化學發光法，試劑由上海百蕊生物科技有限公司提供。質控品采用英國朗道公司腫瘤高、低值質控品，質控判斷標準為Westgard多規則分析。采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測每組對象血清MMP-2水平。步驟如下：所有標本經稀釋(1∶100)后依次加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min(同時加入MMP-2濃度為100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL的3個標準品、陽性和陰性對照)，洗板5次，在避光條件下加入酶標記的單抗室溫孵育40 min，再洗板5次，加入底物反應15 min后終止反應，于美國賽默飛世爾公司Nanodrop ND2000分析儀上檢測吸光值(A)。MMP-2檢測試劑盒由上海百蕊生物科技有限公司提供。同時計算血清CEA與MMP-2檢測的批內、批間變異系數(coefficient of variation，CV)，以評估實驗的重復性和精確度。

1.4 LNC00993表達水平的檢測

按照血清RNA提取試劑盒說明書步驟進行血清總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。熒光定量PCR循環條件：95 °C變性5min；95 °C 30s，60 °C 30s，72 °C 30s，45個循環，每組設置3個復孔。使用的LNC00993與GAPDH引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA的相對表達量，△Ct值=樣本Ct值-GAPDH Ct值。

表1 LNC00993和GAPDH的引物序列

1.5 患者治療

納入的I-II期食管癌患者均給予手術切除并于術后行放化療治療；III-IV期患者均采用放化療保守治療方案。所有患者化療均采用紫杉醇-順鉑方案：于術后第7、14 天 靜脈滴注多西紫杉醇75 mg/m2各1次，1 h；第1、7、14 天 靜脈滴注順鉑25 mg/m2各1次。所有患者放療均采用調強放療方案：患者固定于治療床架后，設置體表標志并行薄層增強CT掃描定位，患者于平靜呼吸下行強化薄層無間隔連續掃描?；颊呔委?個月。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 研究對象的臨床基本信息與血清LNC00993、MMP-2與CEA表達水平

病例組中男性86例，平均年齡(56.3±3.8)歲，其中57人有吸煙史、71人有飲酒史；對照組中男性82例，平均年齡(57.8±3.5)歲，其中55人有吸煙史，68人有飲酒史。兩組間在年齡、性別、吸煙史、飲酒史的差異均無統計學意義(P>0.05)。病例組的血清LNC00993、MMP-2與CEA水平均顯著高于對照組，且差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。血清LNC00993、MMP-2與CEA檢測的批內CV值分別為3.5%和2.4%，批間CV值分別為4.6%和2.8%，均小于5%，提示本實驗樣本檢測具有良好的重復性和精確度。

組別病例組(n=120)對照組(n=120)t值P值LNC00993(-log)121.5±7.511.7±1.27.437<0.001MMP-2,pg/mL43.5±4.317.3±1.44.684<0.001CEA,ng/mL22.5±2.13.2±0.65.763<0.001

2.2 LNC00993、MMP-2和CEA水平與食管癌臨床病理特征的關系

LNC00993、MMP-2與CEA水平與食管癌患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位等均無明顯關系(P>0.05)，而與食管癌的分期、分化程度及組織學類型顯著相關(P<0.05)。且LNC00993、MMP-2與CEA在中晚期食管癌、食管腺鱗癌及低分化食管癌患者中的水平增高最為顯著，見表3。

表3 LNC00993、MMP-2和CEA與食管癌臨床病理特征的關系

2.3 LNC00993、MMP-2和CEA對食管癌的鑒別診斷

ROC曲線分析顯示，血清LNC00993、MMP-2和CEA在區分食管癌與對照組的AUC分別為：0.898(95% CI：0.771～ 0.961，P<0.001)、0.814(95% CI：0.710～0.922，P<0.001)和0.649(95% CI：0.571～ 0.758，P=0.001)；在各指標約登指數為最大值時對應的靈敏度及特異度分別為：靈敏度/特異度分別為：80.9%/84.6%、76.3%/81.5%和69.0%/58.4%；診斷界值分別為：80.6(-log)、35.5 pg/mL和5.8 ng/mL。聯合LNC00993、MMP-2和CEA在區分食管癌與對照組的AUC為0.937(95% CI：0.842～0.981，P<0.001)，靈敏度92.7%，特異度81.8%，見圖1。

2.4 血清LNC00993、MMP-2和CEA水平對食管癌患者的生存分析

采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行生存曲線分析，見圖2。I-II期和III-IV期食管癌患者分別依據LNC00993、MMP-2和CEA水平的中位數被分為高LNC00993與低LNC00993組、高MMP-2與低MMP-2組和高CEA與低CEA組。III-IV期患者中，相比低LNC00993組，高LNC00993組患者的生存時間顯著縮短(χ2=4.138，P=0.047，圖2A)；相比低MMP-2組，高MMP-2組患者的生存時間顯著縮短(χ2=11.369，P=0.002，圖2C)；而高CEA組與低CEA組間的生存時間差異無統計學意義 (χ2=0.258，P=0.715，圖2E)。I-II期患者中，相比低LNC00993組，高LNC00993組患者的生存時間顯著縮短(χ2=7.265，P=0.020，圖2B)；相比低MMP-2組，高MMP-2組患者的生存時間顯著縮短(χ2=9.694，P=0.002，圖2-D)；而高CEA組與低CEA組間的生存時間差異無統計學意義 (χ2=0.137，P=0.924，圖2F)。

3 討論

目前，食管癌的主要篩查手段是脫落細胞學檢查，但該技術的臨床開展仍有諸多不足之處，例如：該檢查的技術含量相對較高，對臨床醫生的技能要求高；該檢測的敏感性和特異性均較低，漏診率較高；具有創傷性。這些均阻礙了該技術在人群中推廣使用。

近年來的研究表明，LncRNA可通過與DNA、RNA或蛋白質結合，在轉錄或轉錄后水平，以順勢調控或反式調控的方式，調節基因的表達，參與幾乎人類所有的生理及病理性生物學過程[5-6]。關于lncRNA與食管癌國內外已有多個研究報道。Chen等[7]發現lncRNA SBF2-AS1在食管鱗狀癌細胞中的表達顯著上調，且在SBF2-AS1被沉默抑制后食管鱗狀癌細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，而SBF2-AS1因此被認為是一種新的食管鱗狀癌生物標志物。Huang等[8]通過對28例食管鱗狀癌患者癌和癌旁組織中lncRNA MEG3表達水平的檢測發現，MEG3基因的表達在癌組織中顯著降低，進一步的機制研究發現MEG3能夠誘導癌細胞的凋亡。上述研究提示，lncRNA的差異表達參與了食管癌的發生、發展過程。值得注意的是，Chen等[9]利用LncRNA芯片技術與生物信息學分析，篩選出了可能調控乳腺癌發生發展的關鍵lncRNA—LINC00993，其在乳腺癌組織和細胞中顯著高表達，且在乳腺癌細胞株中過表達LINC00993后，細胞的增殖活性及克隆形成能力明顯增強、凋亡率顯著降低。而關于LINC00993在食管癌中的表達情況未見報道，其是否具有成為早期腫瘤診斷標志物的潛力是本次研究需要探討的。本研究通過對120例食管癌患者的分析結果發現，血清LINC00993對食管癌的診斷具有重要價值，該部分結果與前期研究基本相符[7-8]。此外，本研究還發現，血清LINC00993水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的升高最為顯著，提示三者與食管癌的不良預后密切相關。最后，本研究組進行了指標的預后評估，發現I-II期和III-IV期食管癌中高LINC00993組患者的生存時間顯著短于低LINC00993組患者，提示食管癌患者血清LINC00993水平在評估患者預后中具有潛在價值，這些研究結果與LINC00993在乳腺癌患者中的機制研究結果相符，提示高表達的LINC00993在提示腫瘤患者預后不良中有一定價值。

近年來國內外多個研究報道指出血清MMP-2在重塑腫瘤微環境、促進腫瘤遠處轉移、以及在腫瘤診斷及預后等評價中具有積極的價值[10-11]。早前的研究已顯示，胃癌患者血漿MMP-2基因表達水平較健康人顯著上調，并認為MMP-2的上調參與到胃癌細胞的遠處轉移[12]。在乳腺癌研究中，Chien等[13]發現癌組織中MMP-2基因表達顯著高于癌旁組織，并指出MMP-2的表達參與腫瘤相關巨噬細胞的活化，是構成腫瘤微環境的重要因素。本次研究，我們首次通過臨床大樣本檢測食管癌患者血清中MMP-2的差異表達，并發現血清MMP-2水平在中晚期食管癌、食管腺鱗癌與低分化食管癌患者中的升高最為顯著，與前期的相關研究相互呼應[12-13]。生存分析發現，I-II期和III-IV期食管癌中高MMP-2組患者的生存時間均顯著短于低MMP-2組患者，提示食管癌患者血清MMP-2水平在評估患者預后中具有潛在價值。

ROC曲線分析顯示，血清LNC00993、MMP-2和CEA在區分食管癌與對照組時具有一定的價值，當聯合LNC00993、MMP-2和CEA等指標時在區分食管癌與對照組時的靈敏度達到92.7%，提示聯合上述三種血清標志物具有較高的臨床應用價值。然而，本次研究仍有如下不足：(1)本研究納入120例食管癌患者，納入的例數仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實LNC00993、MMP-2和CEA在我國食管癌患者中的臨床價值；(2)本次研究中采用的LNC00993、MMP-2和CEA多個指標的聯合模型雖然較各單獨指標有較高的臨床價值，但該模型的應用仍有待進一步的驗證。

綜上所述，本次研究發現了LNC00993、MMP-2和CEA對食管癌的潛在診斷價值，并證實LNC00993與MMP-2對食管癌患者的預后評估具有重要意義，這些發現有望為食管癌的臨床診療提供新的途徑。