模擬氮沉降對常綠闊葉林6種植物氮同化的影響

吳淑華 ，王佳新 ，張世柯 ，王俊，曾陽金，李遠球，劉楠*

1. 廣東省應用植物學重點實驗室/中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650；2. 廣東石門臺國家級自然保護區管理局，廣東 英德 513000；3. 中國科學院大學，北京 100049

大氣氮沉降是一個復雜耦合的過程，指含氮化合物由地表的排放源排放到大氣中，在大氣中經過混合、擴散、轉化和漂移，直到從大氣中移除后重新返回地表（或植物冠層）的過程（Goulding，1990）。大氣氮沉降有干沉降和濕沉降兩種形式，干沉降主要包括NO、N2O和NH3等氣態含氮化合物，濕沉降則主要包括NO3-和NH4+（Wedin et al.，1996）。自 20世紀中期以來，大量燃燒化石燃料，生產和使用含氮肥料，以及集約化畜牧業發展迅速，導致全球范圍內大氣氮沉降速率急劇增加（Galloway et al.，2008；Liu et al.，2013；寧應之等，2018）。中國已發展成為世界第三大氮沉降地區（僅次于歐洲和北美），隨著工業化和城鎮化的發展，氮沉降還在繼續增加（Liu et al.，2011；Jia et al.，2014；Zhan et al.，2014）。氮沉降加劇嚴重影響森林生態系統的健康（Isbell et al.，2011；Chen et al.，2013），對陸地生態系統產生一系列生態風險，如土壤酸化（Lu et al.，2014）、生物多樣性喪失（Sala et al.，2000；Bobbink et al.，2010；Porter et al.，2013；Simkin et al.，2016a；Simkin et al.，2016b）、植物生產力降低（Isbell et al.，2013；Yu et al.，2016）、森林植物氮素分配失調等。

大氣圈中含量最豐富的元素為氮素，它是植物生長所需的大量元素，被稱之為生命元素（Cook，2015）。硝態氮和銨態氮是植物可直接吸收和利用的2種有效態氮源。氮素同化途徑主要包括NR/NiR途徑和GS/GOGAT途徑。首先，硝酸還原酶（NR）將 NO3-還原為 NO2-，亞硝酸還原酶（NiR）又將NO2-還原為 NH4+（Miller et al.，2005）。隨后 NH4+在谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）的催化下進一步被合成谷氨酰胺（Gln）和谷氨酸（Glu）（Lea et al.，1998）。合成后的氨基酸進一步轉化為蛋白質、葉綠素、維生素、核酸、各種細胞器膜組分及細胞壁物質（Kusano et al.，2011）。顯然，外源單輸入（如氮沉降）會對森林植物上述氮同化過程產生直接影響。

氮沉降已被視為全球性問題，氮沉降對森林生態系統的影響及其機理的研究也成為全球研究熱點，目前國際上有關溫帶地區氮沉降對森林生態系統影響的研究較多，且大多集中在含氮化合物、光合產物和生物量的觀測（Vitousek，1994；Chapin et al.，2000；Sala et al.，2000；Edison et al.，2015），而還未就氮沉降對亞熱帶常綠闊葉林優勢植物氮代謝的干擾過程和機理進行分析。亞熱帶是中國社會、經濟和文化的重要區域，在這一區域開展氮沉降對常綠闊葉林優勢森林植物氮同化的影響的研究十分迫切且有重要意義。

1 研究樣地概況、材料及方法

1.1 研究樣地概況

本研究依托中國科學院華南植物園在廣東石門臺國家級自然保護區（東經 113°05′－113°31′，北緯 24°22′－24°31′）建成的林冠模擬氮沉降野外控制試驗平臺（Canopy Addition of Nitrogen，CAN），通過林冠及林下模擬施氮處理（定量噴施NH4NO3溶液），闡明大氣氮沉降增加對森林生態系統結構和功能的影響。

石門臺國家級自然保護區是廣東省面積最大（33555 hm2）、植被保存較好的森林生態系統自然保護區。該區屬南亞熱帶季風型氣候，具有南亞熱帶常綠闊葉林的典型性和過渡性、珍稀性和自然性，對區域生態環境有重大影響。年均溫為20.8 ℃，平均降雨量超過2000 mm。保護區內常綠闊葉林林齡約50年，冠層高度約26 m，林冠郁閉度約92%，喬木層、林下灌木和草本植物種類豐富。保護區的主要植被是天然的次生常綠闊葉林，森林植被以熱帶亞熱帶的代表性科屬為主，優勢科包括殼斗科（Fagaceae）、山茶科（Theaceae）、樟科（Lauraceae）、杜英科（Elaeocarpaceae）、木蘭科（Magnoliaceae）、鼠刺科（Escalloniaceae）、交讓木科（Daphniphyllaceae）、金縷梅科（Hamamelidaceae）、冬青科（Aquifoliaceae）、安息香科（Styracaceae）、杜鵑花科（Ericaceae）及梧桐科（Sterculiaceae）等。該群落的優勢種與優勢科相適應，基本上為殼斗科、山茶科、樟科、杜英科等熱帶亞熱帶成分的種類，這些優勢種類主導著石門臺自然保護區的森林群落類型與結構。

1.2 實驗設計

林冠模擬氮沉降野外控制試驗采用完全隨機區組設計，樣地的設置綜合考慮了植被、坡向和坡度等多種因素，包含4個區組（4個Block代表4個重復），每個區組隨機設置5個樣方，對應5種不同處理，共20個樣方。樣方為半徑17 m的圓形，為防止處理間的干擾，各樣方之間留有約20 m的緩沖帶，中間加裝深度為1 m的PVC隔離板（圖1）。每個圓形樣方中心有一座35 m高三角形鐵塔，一共8座，用于支撐變頻調速恒壓噴灌設備噴灑處理溶液（NH4NO3溶液）。實驗樣地于2012年10月建成，經全面調試以后，于2013年4月啟動實驗處理，處理時間為每年的4－10月（植物生長季），每年共噴灑7次。實驗處理包括：林冠施氮CN25（N 25 kg·hm-2·a-1）、林冠施氮 CN50（N 50 kg·hm-2·a-1）、林下施氮 UN25（N 25 kg·hm-2·a-1）和林下施氮 UN50（N 50 kg·hm-2·a-1）。對照樣方（CT），不噴施N溶液，但噴施相應的水量。

1.3 實驗對象

根據該實驗樣地生物多樣性調查數據，分析每個群落中所有植物的重要值，以重要值占前80%的物種為優勢物種。

植物具有多種獲取氮的途徑：土壤N的吸收、大氣N2的固定、干濕沉降N的吸收等（趙平等，1998）。因此，植物可以通過根吸收土壤中的銨鹽（NH4+）和硝酸鹽（NO3-）及部分有機氮（Killham，1994）。同時，也可以通過冠層葉片吸收氣態氮污染物及濕沉降中的氮，可達到全部氮來源的10%－30%（Krupa，2003）。由于本研究平臺分別通過林冠噴施（首先接觸大喬木的冠層葉片）及林下噴施（主要作用于土壤表層）外源NH4NO3模擬氮沉降，決定了不同層級森林優勢樹種對外源氮素的主要吸收途徑（冠層葉片和根部）。因此，本研究選取了在各個樣方中皆有分布的6種優勢樹種（表1）作為研究對象，包括3個大喬木樹種（錐栗Castanea henryi、荷木 Schima superba、鴨腳木 Schefflera octophflla）和 3個小喬木/灌木樹種（羅傘 Ardisia quinquegona、柏拉木Blastus cochinchinensis、粗葉木Lasianthus chinensis）。

1.4 樣品采集

生長季末，全年氮噴施結束后，于2016年10月進行樣品采集。每個樣方采集每種植物 3－6株成熟植物的當年生葉片，將采集的葉片放置于裝有吸水紙巾的密封袋中，將密封袋放置于裝有冰袋的密封箱中帶回實驗室。稱質量分裝后放在-80 ℃超低溫冰箱中保存以待測定硝態氮和銨態氮含量以及氮同化相關酶活性。

1.5 硝態氮和銨態氮含量的測定

圖1 石門臺樣地分布Fig. 1 plot distribution map of Shimentai

表1 研究對象Tabe 1 Research object

稱取待測植物葉片0.1 g，放入2 mL離心管中，加入1 mL純水，室溫勻漿后，置于90 ℃恒溫搖床中振蕩30 min。待其冷卻后，于12000 g下離心15 min（25 ℃），用移液槍吸取上清液進行硝態氮測定。在濃酸條件下，NO3-可與水楊酸發生反應，生成硝基水楊酸。硝基水楊酸在堿性條件下（pH＞12）呈黃色，在一定的范圍內，其顏色深淺與濃度成正比，故采用比色法測定硝態氮含量（張智良，2003）48。

稱取待測植物葉片0.1 g，放入2 mL離心管中，加入1 mL提取液，室溫勻漿后，于12000 g下離心15 min（25 ℃），用移液槍吸取上清進行測定。α-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經氧化脫氨后變成α-酮酸，酮酸進一步脫羧變成醛，水合茚三酮則被還原。在弱酸環境中，還原型茚三酮，氨與另一分子水合茚三酮反應，縮合生成藍紫色物質，在580 nm處有吸收峰，從而測定銨態氮含量（張智良，2003）49。

1.6 氮同化相關酶活性的測定

NR活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。NR可將NO3-還原成NO2-，在一定條件下，NO2-的生成量與 NR的活性呈正相關，因此以NO2-的生成量代表NR活性。在酸性溶液中，NO2-與磺胺形成重氮鹽，重氮鹽再與 α-萘胺偶聯，形成紫紅色的偶氮化合物，該偶氮化合物在540 nm有最大吸收峰，用分光光度計進行測定。酶活性定義：每小時每克鮮質量樣品中催化產生1 μmol NO2-的量為1個NR活力單位（高俊鳳，2006）61-62。

NiR活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、10000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。NiR可將 NO2-還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2-減少，即540 nm處吸光值的變化可反映葉片中NiR的活性。酶活性定義：每小時每克鮮質量樣品還原1 μmol NO2-的量為1個酶活力單位（高俊鳳，2006）63。

GS活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。谷氨酰胺在ATP和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉化為γ-谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物；該絡合物在 540 nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。酶活性定義：每克鮮質量樣品在1 mL反應體系中每分鐘使540 nm下吸光值變化0.01定義為一個酶活力單位（高俊鳳，2006）64。

GOGAT活性的測定：稱取0.1 g植物葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿后于4 ℃、8000 g下離心10 min，取上清液，置冰上待測。催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸，形成兩分子的谷氨酸；同時NADH氧化生成NAD+，340 nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。酶活性定義：每克鮮質量樣品每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為1個酶活力單位（高俊鳳，2006）65。

1.7 數據處理

運用GraphPad Prism 7.00進行統計分析。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗林冠噴氮或林下噴氮濃度梯度為0、25和50 kg·hm2·a-1對植物葉片硝態氮含量、銨態氮含量及NR、NiR、GS、GOGA酶活性的影響。P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結果

2.1 硝態氮和銨態氮

不同氮添加處理下，粗葉木、鴨腳木和荷木的硝態氮含量皆低于 500 μg·g-1，而柏拉木、羅傘和錐栗的硝態氮含量高達1000 μg·g-1，并且都呈現出顯著性差異。在CN50和UN50處理下，柏拉木和羅傘的硝態氮含量較 CT顯著降低，而 CN25和UN25無顯著性差異。在林冠噴氮（CN25和CN50）和林下施氮（UN25和UN50）處理下，錐栗的硝態氮含量顯著升高（圖2A和圖2B）。不同氮添加處理下，柏拉木葉片銨態氮含量最高，達250 μg·g-1，羅傘次之，其葉片銨態氮含量為 100 μg·g-1。粗葉木、錐栗、鴨腳木和荷木4種植物葉片銨態氮含量均低于 100 μg·g-1。在林冠（CN25 和 CN50）和林下（UN25和UN50）氮添加處理下，柏拉木的銨態氮含量均較CT顯著升高（圖2C和圖2D）。

圖2 氮添加處理對6種植物葉片硝態氮（A和B）和銨態氮（C和D）的影響Fig. 2 Nitrate nitrogen content (A and B) and Ammonium nitrogen content (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

2.2 氮同化相關酶活性

粗葉木和羅傘的NR活性約為1 μg·g-1，其余4種植物較低。柏拉木、錐栗、鴨腳木和荷木的 NR活性約為2 μg·g-1（圖3A、圖3B）。柏拉木的NiR活性最低，約2 μg·g-1。其余5種植物的NiR活性約為6 μg·g-1（圖3A、圖3B）。在CN50處理下，粗葉木和羅傘的NR活性顯著降低，錐栗的NR活性顯著升高。在CN25處理下，柏拉木的NR活性顯著升高（圖3A）。在UN50處理下，柏拉木和錐栗的的NR活性顯著升高（圖3B）。柏拉木較葉片的NiR活性低于其他5種植物。在CN50處理下，粗葉木和柏拉木的 NiR活性顯著升高，而荷木的NiR活性顯著降低（圖3C）。在UN25處理下，粗葉木的NiR活性顯著升高，而羅傘的NiR活性顯著降低。在UN50處理下，錐栗的NiR活性顯著降低（圖3D）。

圖3 氮添加處理對6種植物葉片硝酸還原酶（A和B）和亞硝酸還原酶（C和D）活性的影響Fig. 3 NR activity (A and B) and NiR activity (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

6種植物的GS活性大致相同，其中粗葉木葉片GS活性最高，約為25 μg·g-1（圖4A、圖4B）。粗葉木、羅傘、錐栗、鴨腳木和荷木的GOGAT活性都低于 500 μg·g-1，而柏拉木 GOGAT活性高達1500 μg·g-1（圖 3C、圖 3D）。在 CN50 處理下，柏拉木葉片的 GS活性較CT顯著降低。在 CN25處理下，荷木的GS活性較CT顯著降低（圖4A）。林下氮添加處理（UN25和 UN50）對 6種植物的GS活性無顯著性影響（圖4A）。在林冠氮添加處理（CN25和CN50）下，羅傘和錐栗的GOGAT活性顯著升高（圖4C）。在CN50處理下，羅傘和鴨腳木的GOGAT活性顯著升高。在林下氮添加處理（UN25和UN50）下，錐栗的GOGAT活性顯著升高（圖4D）。

3 討論

3.1 葉片中的硝態氮含量、NR活性和NiR活性對模擬氮沉降的響應

圖4 氮添加處理對6種植物葉片谷氨酰胺合成酶（A和B）和谷氨酸合酶（C和D）活性的影響Fig 4. GS activity (A and B) and GOGAT activity (C and D) of six plant leaves as affected by nitrogen addition

植物中的氮主要以有機氮、硝態氮和亞硝態氮組成。其中，硝態氮和銨態氮是植物可直接吸收和利用的兩種有效態的氮源（喬楓等，2018）。硝態氮在植物體內必須經NR作用還原為銨態氮后才能被吸收和利用（Marschner，2001）。當植物對硝態氮的吸收超過了其還原能力，致使進入植物體內的硝態氮不能及時被還原轉化而出現大量累積。積累在植物體內的硝態氮，其中一大部分儲存于液泡中，小部分存在于細胞質中。一般認為，液泡是硝態氮的儲存庫，細胞質則是硝態氮的代謝庫（許長藹等，1990）。NR和NiR對初級氮同化的控制起著十分重要的作用，并顯著影響植物的生長發育（H?nsch et al.，2001）。NR和NiR皆為誘導酶，NR活性主要受底物NO3-誘導，NiR活性主要受底物NO2-誘導，但同時也受光照溫度等多種因素的影響。本研究發現，在CN50和UN50處理下，柏拉木大量吸收硝態氮，從而誘導了NR活性升高，進而還原更多的硝態氮，導致其葉片硝態氮含量顯著降低。但在CN25和UN25處理下，柏拉木的硝態氮則較少出現顯著性變化。一般認為，25 kg·hm2·a-1施氮量為氮沉降的臨界負荷值（Ye et al.，2018），過量的氮添加導致氮素流失，進一步導致群落植被組成發生變化（Vitousek，1994）。錐栗葉片中的硝態氮含量隨著氮添加濃度的增加而呈梯度顯著升高，這可能說明錐栗可最大限度地吸收硝態氮，NR活性雖在氮添加處理中顯著增加，但NiR并無顯著變化，硝態氮還原為銨的過程可能受阻。植物體內積累過多的 NO2-會影響植物的生長發育（Yamasaki，2000），因而氮沉降有可能會導致該物種的生長受到一定程度的抑制（Clark et al.，2013）。

3.2 葉片中的銨態氮含量、GS活性和GOGAT活性對模擬氮沉降的響應

雖然銨態氮和硝態氮都是植物的氮源，但在兩種氮源可選擇的情況下，不同植物對它們的相對吸收量存在著明顯差異（周碧青等，2017）。這種差異受植物的種類、生育期、土壤溶液pH、2種氮源的濃度等多種因素的影響（Vitousek et al.，1986）。NH4+基本上不能以 NH4+形式被運輸到葉片中，絕大部分在根部被同化，因而對葉片同化氨的酶的促進作用相對小一些。銨態氮的同化由 GS/GOGAT途徑完成，該過程不僅消耗大量ATP，而且消耗大量的碳（Bao et al.，2014）。當銨態氮進入體內后，不能大量貯存，一旦超過其忍受量，便可導致葉片出現斑點、黃化等氨中毒現象（王宇通等，2010）。本研究發現，柏拉木CN50、UN50氮添加處理下，其葉內銨態氮含量顯著升高而大量積累。本研究也發現，在氮添加處理下，柏拉木的葉片確實存在斑點、黃化現象。GS同NR一樣，也是一種誘導酶，然而經銨態氮誘導（Miflin et al.，1980），GS活性未增反降，有研究表明，氮素水平過高時GS活性反而會下降（張智猛等，2008）；GOGAT活性無顯著變化，可能原因是即使NH4+被GS同化為谷氨酰胺，但由于細胞內分隔等原因使其不能有效地成

為GOGAT的底物（鄭朝峰，1986）。本研究結果顯示，氮添加處理下，羅傘、錐栗和鴨腳木GS活性無顯著性變化，而GOGAT活性卻顯著增加，這可能是由于氮添加處理導致了氮同化水平的紊亂（Bao et al.，2014）。

4 結論

氮沉降影響常綠闊葉林優勢植物葉片的氮代謝過程及氮同化關鍵酶活性，進而導致植物的生長發生變化。從氮代謝相關指標來看，氮沉降促進大喬木生長，抑制小喬木/灌木生長。亞熱帶常綠闊葉林優勢種類皆具有一定的抵抗氮沉降能力，但不同類型植物對氮沉降有著不同的響應和忍耐范圍，當超出一定的范圍則會影響植物的生長，對其群落結構產生潛在的影響。