用13C脈沖標記法研究互花米草光合碳的分配

冉珊珊 ，時宇 ，黃黃 ，陳為祥 ，劉金娥 *，蘇海蓉，徐杰

1. 南京師范大學環境學院/江蘇省地理信息資源開發與利用協同創新中心，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省水土環境生態修復工程實驗室，江蘇 南京 210023

互花米草（Spartina alterniflora）是多年生C4草本植物，原產于美國大西洋沿岸，1979年引入中國沿海并迅速擴展。中國海岸帶互花米草植被的覆蓋面積已達到34451 hm2，其中以江蘇海濱濕地的現有面積最大，達18711 hm2（左平等，2009）。光合碳是“大氣-植物-土壤”系統碳循環的重要組成部分，與大氣環境、土壤質量變化關系密切（周廣勝等，2003；尹云鋒等，2010）。植物光合作用是陸地和大氣間碳循環的驅動力，是土壤有機碳的重要來源?；セ撞菅杆贁U張使江蘇鹽城濕地土著種面積不斷減小，對鹽沼土壤碳的輸入輸出及循環產生顯著影響，因此研究互花米草生長光合碳的分配與固定，對濕地碳平衡具有重要意義。

穩定同位素示蹤技術是研究光合碳固定、分配及轉移的重要手段，具有安全、穩定、易操作等優點，目前被廣泛應用在生物地球化學過程的研究中（馮建祥等，2013），國內用13C脈沖法研究植物光合碳的分配主要集中在玉米（何敏毅等，2008）、水稻和小麥（齊鑫等，2008）等作物，但關于互花米草光合碳的分配鮮有研究。本研究利用13C脈沖標記法示蹤互花米草光合碳在互花米草-土壤系統中的分配和去向，為科學評價外來入侵物種互花米草光合碳的分配提供參考，為研究互花米草對濕地碳源與匯的影響提供依據。

1 研究材料與方法

1.1 互花米草室內栽培

于2015年4月采集鹽城濕地表層0－20 cm土壤以及互花米草幼苗植株，將互花米草幼苗植株移栽至PVC管（直徑10 cm，高35 cm）中，2015年4－9月進行室內培養。土壤有機碳7.00 g·kg-1，全氮 1.70 g·kg-1，總磷 0.31 g·kg-1，每盆裝風干土約5 kg，種植互花米草1株，共種植30盆，其中15盆互花米草用13C脈沖標記，另外15盆不做標記處理。

1.2 互花米草13C脈沖標記

標記處理在特制的有機玻璃箱（長×寬×高 1.5 m×0.9 m×1.2 m）內進行，每隔30 d向玻璃箱中通入NaH13CO3與 HCl溶液反應產生的13CO2氣體（NaH13CO3+HCl=NaCl+H2O+13CO2，99 atom%13C），每次NaH13CO3的用量為10 g，共進行4次標記。標記一般在8:00－12:00且晴朗的天氣進行，在標記過程中，箱內溫度控制在28.5－37.6 ℃之間，加入適量冰塊防止箱內溫度過高。在箱內頂部安裝兩個小型風扇保證箱內氣體混合均勻。標記步驟：（1）標記前將栽植互花米草的 PVC盆放入標記箱的底座上，在底座里加入適量冰塊，并放置4個250 mL燒杯，其中兩個放置NaH13CO3各5 g，另外兩個放置NaH12CO3各5 g；（2）將有機玻璃箱放在底座槽內，向底座槽內注滿自來水密封，開啟風扇讓互花米草先光合作用15 min（也有研究者用堿液吸收法將空氣中CO2吸收掉），使互花米草處于饑餓狀態，提高互花米草13CO2的吸收；（3）標記時先用黑布遮住有機玻璃箱，用醫用塑料滴管迅速向裝有NaH13CO3的燒杯中注入250 mL 2 mol·L-1的HCl溶液，待反應5 min后，將黑布移開，讓互花米草在有機玻璃箱內進行光合作用；（4）待標記45 min后，重復步驟（3）繼續向裝有NaH13CO3的另一個燒杯中注入HCl溶液使其產生13CO2氣體，最后2次，向裝有NaH12CO3的燒杯注入HCl溶液使其產生12CO2，以達到較好的標記效果。在2015年6－9月每月對互花米草進行1次脈沖標記實驗，共進行4次。

1.3 樣品采集與分析

在每次標記后的第10天隨機選擇未標記（CK）和標記（BJ）的互花米草各3盆，進行破壞性取樣，收獲互花米草的葉、莖、根、根際土壤以及 PVC管中土體?；セ撞萦谜麴s水洗凈后，放入烘箱內于60 ℃下烘干至恒重，磨碎備用。根際土壤以及土體挑出貝殼、植物根系后自然風干，磨碎，過孔徑0.150 mm篩備用。

互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體的全碳含量、13C自然豐度用同位素質譜儀（Sercon intergra CN）測定。

1.4 指標計算方法

（1）土壤或植物的13C自然豐度用δ13C值表示，公式如下（劉萍等，2015）：

式中，Rsample是樣品13C值和12C值的比值；RPDB是標準物質13C值和12C值的比值，是一個定值，為0.0112372。

標記過土壤或植物一般用同位素豐度F（%）表示，δ13C與F可以相互轉換，轉換公式如下（Lu et al.，2003；齊鑫等，2008）：

（2）互花米草各組分固定13C量計算公式如下（安婷婷等，2013）：

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式中，mCi為各組分碳量；Fm為標記互花米草組分13C豐度；Fum為未標記互花米草組分13C豐度。

各組分13C分配比例P13Ci（%）（安婷婷等，2013）：

式中，m13Ci,ft為互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體固定13C量的總和。

標記效率Em（13C固定百分比）：

1.5 統計分析

運用Excel進行數據整理，SPSS軟件進行統計分析，ArcGIS 9.3和OriginPro 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 互花米草不同器官13C豐度的動態變化

未標記（CK）互花米草根、莖、葉、根際土壤以及土體的13C豐度在4次標記后差異不顯著，其中根、莖、葉13C豐度在1.1443%－1.1573%之間，根際土壤以及土體的13C豐度在 1.1121%－1.1125%之間（圖1a）。未標記的互花米草13C豐度呈現由地上部分向地下部分遞減的規律，其中土體13C豐度波動較小，比較穩定。在4次同位素脈沖標記后，與未標記組相比，標記后（BJ）互花米草各組分以及土壤的13C豐度值都呈現明顯上升趨勢（圖1b），但根際土壤、土體相對植物根、莖、葉變化不明顯，較穩定?；セ撞菰诮涍^第4次標記后的第10天收獲，收獲后測定的互花米草根、莖、葉 δ13C 值分別為 397.23‰、721.77‰、606.07‰、69.4‰和29.4‰，根際土壤δ13C值也高達29.4‰，明顯發生了富集。

圖1 互花米草-土壤系統13C豐度值Fig. 1 Abundance value(F) of 13C in S. alterniflora-soil system

2.2 凈光合13C在植物-土壤中的分配

2.2.1 互花米草-土壤系統中各組分固定13C量

在每次標記結束后取樣，測定葉、莖、根和土壤中的13C含量，計算其固定13C量以及在各部分的分配比例。4次標記各器官總共固定的13C量分別為 52.80、125.20、217.11和 276.81 mg·plant-1（以C計）。4次標記后，互花米草各個器官（葉、莖、根）、根際土壤以及土體固定的13C量隨標記次數增加而逐漸增加，固定13C量呈現莖、葉、根、根際土壤、土體逐漸減小的趨勢（表1）?；セ撞?土壤體系中，各組分固定的碳量隨著標記次數增加而逐漸增加，但互花米草固定的13C主要集中在地上部分（莖、葉）。土體中碳含量逐漸增加，表明在供試土壤條件下，互花米草生長促進了土壤碳匯的作用。

2.2.213C在互花米草各部位及土壤中的分配比列

各組分固定13C占凈光合13C的比例稱為該組分13C的分配比例。4次標記后，葉、莖、根、根際土壤以及土體各組分固定13C量占凈光合13C總量分配比例按莖、葉、根、根際土壤、土體依序逐漸減少（圖2）?；セ撞萑~固定13C量分配比例在32.48%－39.20%之間；莖固定13C量分配比例在39.83%－47.65%之間；根固定13C量分配比例在18.01%－20.34%之間；根際土壤固定13C量分配比例較穩定，波動較小，隨標記次數增加呈先增加后下降再上升的規律，分配比例在 0.30%－0.42%之間；土體固定的13C量占凈光合碳的比重較小，隨標記次數增加呈現上升的趨勢，分配比例在0.08%－0.20%之間。光合作用固定13C在地上部分（莖、葉）的分配比例在 75.36%－81.13%之間，地下部分（根、根際土壤、土體）的分配比例在 18.51%－24.63%之間。地上部分固定的13C顯著高于地下部分。

圖2 13C在互花米草-土壤系統各組分中的分配比例Fig. 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C in S.alterniflora-soil system

表1 不同標記次數后凈光合固定13C的量Table 1 Net photosynthesized 13C distribution in each part of S. alterniflora-soil system

2.3 13C脈沖標記互花米草-土壤系統中的標記效率

13C的標記效率是指互花米草-土壤系統中各組分固定13C的量與標記時輸入系統中13C的量的百分比。根據互花米草莖、葉、根、根際土壤和土體的13C豐度以及標記時輸入系統中13C量，可以計算13C的標記效率。根據加入的標記物，計算出每次標記時輸入的13C量為1.51 g。4次標記后的標記效率在 3.47%－4.77%之間，標記效率隨標記次數增加而先增加后降低（圖3）。尹云鋒等（2010）通過 5次脈沖標記使水稻的標記效率為 35%，與Rees et al.（2005）研究的小麥的標記效率大致一致，但本研究標記效率在 3.47%－4.77%，與前人研究相比，相對較低。

圖3 互花米草標記效率Fig. 3 Fixed proportion of 13C in S. alterniflora-soil system

3 討論

3.1 互花米草-土壤系統中13C富集程度

穩定碳同位素技術目前已被廣泛應用于各個研究領域，13C標記法與14C標記法相比，具有無放射性、較安全、標記均勻等優點（尹云鋒等，2007）。隨著穩定碳同位素測定技術的改進和提高，利用穩定碳同位素變化研究各個生長時期植物光合產物的去向，植物的秸稈、殘茬或根系在土壤中的分解動態變化和在土壤有機碳不同組分中的分配，已經成為一個重要的方法和手段（Dmjs et al.，2002）。

13C標記可分為連續標記和脈沖標記，本文采用脈沖標記法，在植物生長的各個生育期均提供標記以提高標記效率。本研究中，經過4次13C標記后，互花米草各個器官（葉、莖和根）、根際土壤以及土體的 δ13C值分別為 606.07‰、721.77‰、397.23‰、69.4‰和 29.4‰，這說明本實驗標記可以獲得較滿意的富集13C互花米草材料。這與Lu et al.（2003）的研究一致。Simard et al.（1997）也發現白樺（Betula platyphylla）和花旗松（Pseudotsuga menziesii）脈沖標記半小時后，其葉子13C值明顯發生富集，分別達到660‰、460‰，與本文研究一致。4次標記后，互花米草13C豐度變化表現為莖＞葉＞根＞根際土壤＞土體。安婷婷等（2013）標記玉米1 d后，同一處理組13C豐度變化表現為莖葉＞根＞根際土壤＞土體（劉萍等，2015）；Butler et al.（2004）在苗期對黑麥草進行標記，標記后1 d得出的結果同樣如此，均與本研究結論一致。Bromand et al.（2001）利用脈沖標記技術標記 13次后收獲測得小麥器官的δ13C值為2140‰－2370‰，與本研究相差2－3倍。說明標記后植物富集13C結果的差異與標記次數、標記時間（安婷婷等，2013）、植物類型及其生長期不同有關。

3.2 互花米草-土壤系統中各組分固定13C量

有研究表明，土壤呼吸損失碳量占同化碳總量的40%以上（Kuzyakov et al.，2001），但需要在特定可控制的實驗條件下進行研究，本研究沒有考慮呼吸的作用?；セ撞莨潭?3C量主要指根、莖、葉、根際土壤和土體固定13C量之和。各組分固定13C量呈現莖、葉、根、根際土壤、土體依序遞減的趨勢，13C的分配比呈現同樣規律。盡管土體中13C變化趨勢不明顯，但也呈現出明顯的上升趨勢，這可能是光合固定的13C通過根系將根際沉積物輸入土壤，被土壤微生物吸收和利用，導致土體中值有所上升（馬真等，2016）。Wu et al.（2010）在矮嵩草（Kobresia humips）草甸上標記32 d后發現31%左右的13C進入地下活根中，Fan et al.（2008）也研究發現，標記27 d后20%－40%的光合碳進入到地下，這都與本研究一致。本研究中，光合作用固定的13C在地上部分（莖、葉）的分配比例在75.36%－81.13%之間，地下部分（根、根際土壤、土體）的分配比例在 18.51%－24.63%之間。與Kuzyakov et al.（2004）研究的小麥、牧草、玉米地上（莖、葉）和地下（根、土體、根際呼吸）部分光合碳的分配比例（表2）相比，互花米草地上部分分配比例相對較大，地下部分分配相對較小，這可能是因為本研究互花米草在室內培養，受條件限制，互花米草地上部分生物量比較小，存在相對濃縮作用（喬云發等，2010），地下部分分配比例相對較小是因為本研究中未考慮土壤和互花米草的呼吸作用。加上小麥、牧草具有較大的植物根系，能固定更多的13C。其他研究者得出柳枝稷（Panicum virgatum）固定13C的比例在42%－79%之間（Chaudhary et al.，2012），蠶豆（Vicia faba）固定13C比例41%－67%（Fan et al.，2008）。

表2 不同植物光合13C的分配比例Table 2 Percentage distribution of the net assimilated 13C of different plants

4 結論

未標記組各組分的13C豐度在4次標記后差異顯著；互花米草在4次穩定碳同位素脈沖標記后，植物根、莖、葉、根際土壤以及土體13C豐度值都有明顯上升趨勢。13C豐度隨標記的次數而增加；4次標記固定的13C量分別為52.80、125.20、217.11、276.81 mg·plant-1，各部分固定的13C量隨標記次數增加而增加，而且地上部分固定13C量和分配比例都明顯大于地下部分。