蠶豆納豆發酵工藝優化及其酶學性質

,,*, ,文剛

(1.青海大學農林科學院,青海西寧 810016;2.青海省農林科學院,青海西寧 810016;3.青海省青藏高原農產品加工重點實驗室,青海西寧 810016)

納豆(natto)是一種源于日本且歷史悠久的傳統發酵食品[1],具有多種醫療保健功效[2],其中包括防止骨質疏松、抗致病菌、促凝血、延緩衰老等,受到廣大學者的特別重視。納豆激酶(Nattokinase,NK)作為納豆發揮保健功效的主要功能因子,其顯著的降血栓功能使其成為當前納豆研究的熱點和焦點。目前已有很多相關報道證實納豆激酶的功能特性主要表現為溶栓作用[3-4],同時納豆激酶具備高安全性、低成本、經口服后能夠迅速入血[5]及在胃腸中具有良好穩定性等優點[6-9],因而納豆激酶作為新一代的溶栓藥物[10-11]具有廣闊的開發前景。

蠶豆俗稱胡豆、南豆、羅漢豆、佛豆、川豆、寒豆和利馬豆等[12],蠶豆營養豐富,其淀粉及蛋白質含量高、脂肪含量低,是一種糧食、蔬菜和飼肥兼用的作物[13-14]。與傳統發酵納豆的原料黃豆相比,蠶豆含有豐富的淀粉、脂肪含量低,更利于納豆枯草芽孢桿菌的生物利用,無需外加碳源物質就能達到高效發酵,同時改善其原有的風味和口感。目前,有少量學者以蕓豆[15]、紅豆[16-17]、黑豆[18-19]和鷹嘴豆[20-21]作為納豆發酵主要原料開發新型保健產品,其納豆激酶活力及口感均得到一定程度的改善。李宏梁等[15]以蕓豆為原材料,研究蕓豆納豆最佳發酵工藝條件,結果表明,蕓豆用3倍的水浸泡10 h,加入0.5% NaCl,蒸汽滅菌鍋內121 ℃下蒸煮35 min,冷卻至45 ℃以下進行接種,接種量為9%,37 ℃下發酵20 h,溫度4 ℃下老化24 h,其感官評定值達到9.6分。王琳等人以紅豆為原料,應用響應面法優化紅豆納豆的發酵工藝。結果表明,紅豆納豆最佳發酵條件為接種量6%、接種種齡18 h、發酵時間21.5 h,在此發酵工藝條件下,感官評分為97.7分,納豆激酶酶活力為1140 U/g[17]。而以蠶豆為材料發酵納豆的相關研究報道甚少,至今未見蠶豆在納豆食品領域中的應用。另外,當前蠶豆的主要加工方式多以油炸蠶豆的休閑食品為主,其加工水平低,產品花樣少,產品檔次低,其價值沒有得到合理的開發與利用。

因此,本研究旨在創新蠶豆納豆發酵工藝,開發新型納豆產品,解決蠶豆產品加工單一難題,提高納豆激酶活力,同時探明蠶豆發酵產納豆激酶的酶學特性,為后續蠶豆—納豆激酶產品進一步加工及利用奠定基礎,指導蠶豆健康消費方面具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青海GF47蠶豆 綠子葉、干蠶豆,儲存期1年,由青海作物育種栽培研究所蠶豆研究室提供;納豆枯草芽孢桿菌BSCZ-4 實驗室誘變保存菌株[9];尿激酶(5 KU) 購自北京雅安達生物技術有限公司；凝血酶(1000 U/支)、牛纖維蛋白原 購自Sigma公司;其余試劑 均為分析純。菌種培養基:液體培養基 蛋白胨5.0 g,牛肉膏3.0 g,NaCl 5.0 g,蒸餾水1.0 L,pH7.0。

101A-2ET電熱鼓風干燥箱 上海實驗室儀器廠有限公司;LRH-150生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司;BCD-649WE冰箱 輕道海爾股份有限公司;SW-CJ-2D型(實用垂直新穎)雙人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;KG-SX-500電熱手提高壓消毒器 KAGOSHIMA SEISAKUSYO IMC;AL204電子天秤 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器有限公司;DL-5M低俗冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;BDP-207C超低有機物型純水機 南京權申生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 參照文獻[22-23]的方法,用接種環挑取BSCZ-4斜面菌種兩環,接種于裝有100 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶中,37 ℃、150 r/min搖床培養15 h。

1.2.2 蠶豆納豆發酵工藝流程 蠶豆→挑選→清洗→常溫浸泡→瀝干→常壓蒸煮→冷卻→接種→發酵→后熟→成品

挑選、清洗:選用蠶豆飽滿、去除殘豆、雜豆、泥土,清洗后用紗布瀝干;后熟:將發酵后的蠶豆納豆放置于4 ℃冰箱,放置24 h。

1.2.3 粗酶液的制備 參照張杰等[24]的方法。將發酵后的蠶豆納豆按1∶2 (g/g)加入生理鹽水,4 ℃下浸提24 h。并在4500 r·min-1條件下離心20 min,上清液即為納豆激酶粗酶液。

1.2.4 納豆激酶酶活力值測定 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[25],并結合文獻[9]的方法測定酶活力值。得到尿激酶標準曲線為:y=0.003x+0.3937,相關系數R2=0.9976。式中:y為溶解圈面積,x為酶活力值。

1.2.5 蠶豆納豆發酵工藝單因素實驗 取GF47蠶豆,在浸泡時間為48 h、常壓蒸煮20 min、接種量8%、37 ℃下培養60 h的恒定條件下,分別考察接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、浸泡時間(18、24、30、36、42、48 h)、蒸煮時間(10、15、20、25、30 min)、發酵溫度(31、34、37、40、43 ℃)、發酵時間(24、36、48、60、72 h)對蠶豆納豆發酵工藝的影響。

1.2.6 正交試驗 根據單因素試驗結果,以感官評分及納豆激酶酶活力為指標,采用L9(34)正交試驗法對固態發酵條件中接種量、蒸煮時間、發酵溫度、發酵時間4個影響因素進行優化,因素水平表如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 感官評定 采用評分法進行感官評定,以發酵得到的蠶豆納豆產品的拉絲情況、氣味、顏色和口感為評定指標,組織10名(5男5女)經過基礎培訓的人員對蠶豆納豆產品進行評分,取平均值,評分標準見表2。

表2 納豆感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of natto

1.2.8 蠶豆納豆激酶酶學性質研究

1.2.8.1 熱穩定性 將制備得到的粗酶液置于不同溫度(25、30、40、50,60、70 ℃)的水浴中,在此條件下保溫3 h,以25 ℃保溫3 h的酶活力為100%,測定并計算其相對酶活[26]。

1.2.8.2 保溫時間穩定性 將制備得到的粗酶液在40 ℃的水浴中保溫不同時間(30、60、90、120、150、180 min),以最高的酶活力為相對酶活100%,測定并計算出其相對酶活[26]。

1.2.8.3 pH穩定性 將粗酶液加入到等體積不同pH(4、5、6、7、8、9、10、11)的緩沖液中,并在室溫下孵育24 h,以其中最高酶活力時為100%,測定并計算出其相對酶活[26]。

1.2.8.4 金屬離子穩定性 將900 μL粗酶液分別與50 mmol/L的Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+溶液100和20 μL混合,加蒸餾水補充至1 mL,即配成含金屬離子5和1 mmol·L-1的酶液。將配制好的酶液置于37 ℃下孵育18 h,以無金屬離子的納豆激酶酶活為100%,測定得到相對酶活[26]。

1.3 數據統計分析

所有實驗均重復3次。數據用DPS 6.5進行方差分析和多重比較,以p<0.05為顯著性檢驗標準。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 接種量對蠶豆納豆發酵工藝的影響 由圖1可知,隨著接種量的增加,納豆激酶活力及感官評分均呈現先增大后減小的趨勢,當接種量<4%時,納豆激酶酶活力及感官評分均相對較低,這主要是由于接種量小,使得接入的納豆枯草芽孢桿菌菌數少,生長緩慢、發酵遲緩,從而導致蠶豆納豆粘度較低、拉絲較少,納豆外觀無色澤,咀嚼香味不濃郁,產酶活力低;而當接種量>8%時,菌株生長過快,且菌株之間相互影響,加之蠶豆表面產生粘稠物質阻礙菌株供養,此時不利于菌株的生長和發酵,致使產酶活力降低[9]、發酵物相互黏連成塊、感官較差。綜上所述,選擇4%、6%和8%的接種量作為下一步正交試驗的3個水平。

圖1 接種量對蠶豆納豆發酵工藝的影響Fig.1 Effects of inoculum on fermentation process of natto by broad bean注:圖中小寫字母不同表示同一指標 差異顯著(p<0.05),圖2～圖8同。

2.1.2 浸泡時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響 蠶豆的浸泡時間對整個發酵過程有著重要的影響,由圖2可知,隨著浸泡時間的增長,納豆激酶活力值及感官評分呈現逐漸增大的趨勢,48 h后趨于穩定。當浸泡時間為48 h時,此時酶活力最大,為(3400.52±124.54) U·g-1,感官評分為(85.22±0.83)分。這是由于當蠶豆浸泡時間過短,其籽粒過硬,致使蠶豆納豆口感較差、不酥軟,同時由于水分不充足,對于納豆枯草芽孢桿菌的發酵產生一定抑制[15],酶活較低;當浸泡48 h后,蠶豆達到充分浸泡,繼續浸泡產酶活力及感官評分趨于穩定。由多重比較分析結果可知,浸泡時間達48 h后酶活力無顯著差異,據此確定出正交試驗中浸泡時間為48 h。

圖2 浸泡時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響Fig.2 Effects of soaking time on fermentation process of natto by broad bean

2.1.3 蒸煮時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響 蒸煮時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響如圖3所示,隨著蒸煮時間的增加,蠶豆籽粒由硬變軟,其納豆激酶活力及感官評分呈現先增大后減小的趨勢,當蒸煮時間為20 min時發酵所得的納豆激酶酶活力值最高,為(3382.14±375.363) U·g-1,此時感官品質相對較高,其感官評分達到(85.96±1.59)分。而當蒸煮時間過長,其營養物質損失較多,發酵產物較少,結合多重比較的結果,選擇15、20和25 min為正交試驗水平。

圖3 蒸煮時間對納蠶豆納豆發酵工藝的影響Fig.3 Effects of cooking time on fermentation process of natto by broad bean

2.1.4 發酵溫度對蠶豆納豆發酵工藝的影響 微生物在發酵產酶過程中,適宜的發酵溫度是保證酶活力的主要因素之一。由圖4可知,隨著發酵溫度的增高,納豆激酶酶活力及感官評分呈現先增大后減小的趨勢,當發酵溫度為37 ℃時,所得納豆激酶酶活力最大,為(3907.64±102.85) U·g-1。感官評價結果表明,當溫度37～43 ℃,發酵產物色澤鮮亮、口感酥軟、感官評分較高,此溫度范圍為納豆枯草芽孢桿菌最適溫度范圍,且此范圍內納豆激酶酶活力也高于其他水平,因此綜合考慮,選擇37、40、43 ℃為正交試驗水平。

圖4 發酵溫度對蠶豆納豆發酵工藝的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on fermentation process of natto by broad bean

2.1.5 發酵時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響 發酵時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響如圖5所示,隨著發酵時間的增加,納豆激酶活力值及感官評分呈現先上升后下降的趨勢。在發酵溫度為60 h時,納豆激酶活力達到最大值,為(3851.14±228.66) U·g-1,此時感官評分為(88.78±3.07)分。隨著發酵時間的延長,感官評價分得分基本趨于穩定。而當進一步增加發酵時長時,納豆激酶的活力值又略微下降。這主要是由于發酵時間過短,蠶豆納豆口感不軟糯,納豆激酶活力低,其保健功效不理想,而發酵時間過長,納豆的氨味較為濃郁,影響其風味。鑒于此,選擇發酵48、60、72 h作為正交試驗的3個水平。

圖5 發酵時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響Fig.5 Effects of fermentation time on fermentation process of natto by broad bean

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗結果分析 在單因素實驗基礎上選擇接種量、蒸煮時間、發酵溫度、發酵時間作為試驗四因素,按L9(34)正交表進行試驗,確定最優發酵工藝參數。正交試驗結果及分析見表3、表4。

表3 正交試驗結果及分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal test

由正交試驗結果和方差分析表4可知,接種量(A)、蒸煮時間(B)、發酵溫度(C)、發酵時間(D)對蠶豆納豆發酵工藝的影響均達到極顯著水平(p<0.01),其中蒸煮時間對蠶豆納豆發酵工藝的影響最大,為決定性因素。蠶豆納豆發酵工藝的最優組合為A2B2C2D3,即接種量為6%,蒸煮時間為20 min,發酵溫度為40 ℃,發酵時間為72 h。

2.2.2 驗證試驗結果分析 根據正交試驗結果其最優組合為A2B2C2D3,進行多次重復性(n=3)驗證性試驗,測得納豆激酶活力值為(4860.13±470.02) U·g-1,感官評分為(95.67±0.71)分,與傳統黃豆采用相同菌株發酵納豆激酶[24]相比極顯著(p<0.01)提高,所得到的正交試驗結果準確合理,具有一定的應用價值。

2.3 蠶豆納豆激酶酶學性質結果分析

2.3.1 熱穩定性分析 由圖6可知,蠶豆固態發酵產生的納豆激酶在高溫下不穩定,當溫度高于50 ℃時,該酶活性下降迅速且差異顯著;當溫度升至70 ℃時,該酶相對酶活僅為19.41%;而當溫度較低,在25～40 ℃時,酶活損失較小且差異不顯著,40 ℃時相對酶活達到90.05%以上。這可能是由于當溫度過高時,納豆激酶結構受到破壞,致使酶失活[27]。因此,在后續納豆激酶的儲存和加工利用上,應控制溫度40 ℃以下,減少其納豆激酶的損失。

圖6 溫度對納豆激酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on nattokinase activity

2.3.2 保溫穩定性分析 由圖7可知,在40 ℃下隨著保溫時間的延長納豆激酶的酶活力值逐漸降低,但整體下降趨勢較為平緩,當保溫時間達到90 min時,隨著時間的延長,納豆激酶酶活力值趨于穩定,此時相對酶活達到84.09%。根據多重比較的結果可知,保溫時間60 min后對納豆激酶活力無顯著影響,納豆激酶較為穩定。

圖7 保溫時間對納豆激酶活力的影響Fig.7 Effects of incubation time on nattokinase activity

2.3.3 pH穩定性分析 由圖8可知,在pH6～9時,蠶豆固態發酵產生的納豆激酶活性相對比較穩定,其相對酶活在89.05%～100%之間。而當pH低于6時,納豆激酶損失嚴重,pH為4時,其相對酶活僅為28.11%;而當pH高于9時,納豆激酶活力值迅速下降。結果說明納豆激酶耐受pH具有選擇性,因此在后續加工、儲存時,選擇pH6～9有助于保持納豆激酶活力。

圖8 pH對納豆激酶活力的影響Fig.8 Effects of pH on nattokinase activity

2.3.4 金屬離子穩定性分析 由表5可知,當金屬離子濃度為1 mmol·L-1時,Mg2+和Ca2+對蠶豆發酵得到的納豆激酶活力具有促進作用;而當金屬濃度增加至5 mmol·L-1時,Mg2+和Ca2+對納豆激酶活力促進增強。另外,Cu2+、Fe3+對納豆激酶活力具有抑制作用,隨著金屬離子濃度的增加抑制作用增強;Zn2+對納豆激酶活性的影響無明顯作用。因此,在實際生產加工中,添加Mg2+和Ca2+可增強納豆激酶的穩定性,降低納豆激酶活力的損失。

表5 金屬離子對納豆激酶活力的影響Table 5 Effects of metal ions on nattokinase activity

3 結論

本試驗對蠶豆固態發酵產納豆激酶工藝進行優化,得到最佳提取工藝為蠶豆浸泡時間為48 h,蒸煮時間為20 min,接種量為6%,發酵溫度為40 ℃,發酵時間為72 h,在此條件下,納豆激酶酶活力達到最高,為4860.13±470.02 U·g-1,感官評分為95.67±0.71分。該酶在25～40 ℃具有較好的熱穩定性;pH在6～9范圍內其酶較為穩定,保持相對酶活89.05%以上;Mg2+和Ca2+對納豆激酶活性具有促進作用,Cu2+、Fe3+抑制作用明顯,Zn2+無明顯作用。本研究為推廣蠶豆資源的利用,增加納豆新品種,開闊市場,提高其綜合加工利用率和附加值提供了重要的途徑。