GPC1和PD-1在非小細胞肺癌組織中表達及其與患者預后的相關性

劉彤媌 宋卓 王玫紅 趙煥

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院呼吸一科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

腫瘤免疫研究表明，免疫抑制是腫瘤的主要特征之一，T細胞介導的腫瘤抗原識別、提呈及活化在腫瘤免疫應答中具有重要意義〔1〕。協同刺激分子包括共刺激分子和共抑制分子，負責提供T細胞活化所需的第二信號。程序性細胞死亡蛋白(PD)-1是目前研究較多的共抑制分子，與相應配體結合后，對T 細胞的激活發揮負調節作用。GPC1是一種廣泛存在的蛋白聚糖大分子，為肝素結合生長因子的共受體，與HBGFs促細胞有絲分裂活動有關。研究發現 GPC1在胰腺癌、乳腺癌及神經膠質瘤中均有高表達〔2〕。本研究通過分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者GPC1和PD-1的表達情況，探討其與NSCLC發生發展及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2010年1月至2012年1月齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院收治的70例NSCLC患者為患者組，均經病理診斷證實。根據世界衛生組織(WHO)標準進行病理學檢查，并根據 TNM 國際分期法(UICC，2009)進行分期。男42例，女28例，年齡37～71歲，平均(52.4±5.8)歲；鱗癌45例，腺癌25例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期24例，Ⅳ期7例。另取同期來院體檢的健康人群30例為對照組，男17例，女13例，年齡35～76歲，平均(56.7±6.6)歲。兩組性別、年齡等相比無顯著性差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 兩組空腹采集肘靜脈血5 ml，3 000 r/min離心15 min，取上層血漿，置于EP管中并做好標記，采用Elivison二步法檢測血清中GPC1和PD-1水平，一抗4℃過夜孵育，室溫下與二抗結合30 min，切片采用DAB顯色，蘇木精復染。采用ABCOM公司的PD-1鼠抗人單克隆抗體(1∶100稀釋)及GPC1試劑盒進行檢測。對70例患者進行術后隨訪，隨訪時間從手術結束后開始，至2017年1月，觀察患者是否出現復發或轉移，比較GPC1和PD-1陰性表達組與陽性表達組患者的生存率，分析GPC1和PD-1與疾病預后的相關性。

1.3質量控制 納入標準：(1)患者均有影像學和病理學資料證實為原發NSCLC；(2)所有患者知情同意并且簽署知情同意書。排除標準：(1)復發腫瘤或者多重癌；(2)患者存在嚴重感染；(3)并發血液系統、免疫系統病變者。質量控制要求：(1)根據納入、排除標準嚴格篩選入組病例。(2)所有病例術前未接受過放化療，未使用糖皮質激素及非甾體類藥物；術中癌組織和癌旁組織病理標本齊全；半年內體重減輕<10%，術后無嚴重并發癥；Ⅰ期患者至復發后才接受全身化療，Ⅱ、Ⅲ期患者術后接受過至少2個周期含鉑方案的聯合化療或放療。(3)根據試劑說明書和預實驗結果確定最佳的試劑稀釋濃度及抗原修復方法。(4)免疫組化染色過程中設立陰性對照。(5)使用前調校實驗相關儀器，準確控制實驗溫度及時間。(6)實驗結果采用盲法進行判定。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier(K-M)生存分析法比較陽性組與陰性組患者的生存情況。

2 結 果

2.1兩組GPC1、PD-1陽性率比較 患者組GPC1、PD-1陽性率分別為80.0%(56例)與72.9%(51例)，遠高于對照組的10.0%(3例)與6.7%(2例)，差異具有統計學意義(χ2=42.538,39.935;均P<0.05)。

2.2GPC1、PD-1表達與患者臨床病理參數的關系 GPC1、PD-1陽性表達與的TNM分期及淋巴結轉移情況密切相關(P<0.05)，與患者的性別、年齡、病理分型無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1 GPC1、PD-1表達與患者臨床病理參數的關系(n)

2.3GPC1陽性組和陰性組生存時間比較 隨訪患者時間最短8個月，最長60個月。GPC1陽性組中位生存時間31.0個月，3年、5年累計生存率分別為32.1%(18例)和7.1%(4例)；GPC1陰性組中位生存時間54.5個月，與陽性組比較差異顯著(K-M生存分析χ2=5.42，P=0.019 9)；GPC1陰性組3年、5年累計生存率分別為64.3%(9例)與35.7%(5例)，均高于PD-1陽性組(χ2=4.45，5.81；均P<0.05)。見圖1。

2.4PD-1陽性組和陰性組生存時間比較 PD-1陽性組中位生存時間29.0個月，其3年、5年累計生存率分別為31.4%(16例)和7.8%(4例)；PD-1陰性組中位生存時間51.0個月，3年、5年累計生存率分別為68.4%(13例)與31.6%(6例)，組間比較PD-1陰性組的生存時間(K-M生存分析χ2=10.82，P=0.001)及3、5年累計生存率均高于PD-1陽性組(χ2=7.83,4.58;均P<0.05)。見圖2。

2.5生存時間影響因素分析 TNM分期、淋巴結轉移、GPC1陽性及PD-1陽性是NSCLC患者生存時間的影響因素。見表2。

圖1 GPC1陽性組和陰性組生存率比較

圖2 PD-1陽性組和陰性組生存率比較

影響因素BS.E.P值95% CITNM分期0.7830.1060.0000.588 7～1.011 3淋巴結轉移0.8730.1460.0000.509 1～1.090 9GPC1陽性0.6840.1220.0001.068 2～1.946 4PD-1陽性0.6910.1260.0001.084 4～1.957 8

3 討 論

肺癌的發病率和死亡率在全球惡性腫瘤范圍內均居首位，每年約新增病例130萬例。大部分患者在發現時已屬晚期，錯過最佳治療時機，因此尋找早期敏感的診斷指標一直為人們所關注〔3〕。

PD-1多表達于活化T細胞表面，與相關配體PD-L1結合后為T細胞提供抑制性第二信號，使T細胞信號通路上的轉錄因子去磷酸化失活，從而抑制T細胞的活化增殖和白細胞介素(IL)-10、干擾素(IFN)-γ等細胞因子的產生，發揮免疫自穩功能，避免免疫激活帶來的機體損傷，這也成為腫瘤細胞逃避免疫系統攻擊的主要機制之一〔4〕。目前研究已證實，PD-1在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織中高表達，且與患者的預后相關〔5，6〕。本研究結果顯示，GPC1、PD-1高表達與腫瘤的發生、發展及預后均具有相關性。GPC1是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)家族的成員之一，通過糖基磷脂酰肌醇附著于細胞膜表面，與腫瘤細胞的增殖、轉移和血管生成有關，在多種腫瘤細胞上高表達〔7〕。GPC1多附著于細胞膜表面，因此之前研究結論也均是基于組織或細胞獲得的〔8〕。外泌體是在多泡體內形成的小囊泡，可通過胞吐釋放至血液、尿液等多種體液中，外泌體膜表面分布的蛋白與其來源細胞的分子指紋和細胞狀態帶有契合性，且可通過非侵入性途徑檢測到。已有報道在胰腺癌患者的血清中檢測到了GPC1陽性的外泌體，提示外泌體膜蛋白GPC1檢測可作為腫瘤診斷的一種便捷手段〔9〕。本研究結果顯示GPC1、PD-1在NSCLC組織中表達增加，并提示腫瘤惡性程度高、預后不良，可作為判斷患者預后的指標，為NSCLC的治療提供了新靶點。