松果菊苷對大鼠Leydig細胞衰老模型AXL和wnt2b基因的影響

孫靜 龐云瑞 單博穎 薛亞然 牛嗣云 鄭立雙 郗昕

(1河北大學醫學院組織學胚胎學教研室，河北 保定 071000；2保定市第一醫院藥學部;3河北大學附屬醫院中心實驗室)

根據甲基化芯片篩查結果〔1〕，從中選出甲基化基因AXL和wnt2b，通過熒光定量聚合酶鏈式反應qRT-PCR、甲基化特異性PCR(MSP)檢測技術，證明了肉蓯蓉能夠調控睪丸組織AXL和wnt2b基因的表達。本研究擬探討松果菊苷對大鼠睪丸間質(Leydig)細胞衰老模型AXL和wnt2b基因的影響。

1 材料和方法

1.1睪丸間質(Leydig)細胞的原代培養和純度鑒定 取用2周齡Wistar雄性大鼠幼崽，無菌取出雙側睪丸組織，浸泡于預冷的PBS中。剝離睪丸組織中白膜，分離得到新鮮、結構完整的睪丸組織。無菌膠原酶Ⅰ消化后，差異貼壁法分離、培養Leydig細胞。

1.2Leydig細胞衰老模型建立與鑒定 依據“自由基氧化損傷”理論〔2〕建立間質細胞衰老模型，將新鮮配制的過氧化氫(H2O2)和FeSO4加入已培養2 d的細胞中，使濃度分別為50 μmol/L和100 μmol/L，作用時間分別為8 h(即各加入的體積為2 μl)，成功建立了細胞衰老模型，并用 β-半乳糖苷酶染色成功鑒定細胞衰老狀態〔3〕。

1.3噻唑鹽(MTT)比色法篩選松果菊苷作用最適濃度 在培養2 d的細胞中加入不同濃度的松果菊苷進行藥物處理，濃度梯度設置為10、20、40、80、160和320 μmol/L，持續作用1、2、3 d，上機檢測后計算細胞增殖活力，選擇最佳作用于Leydig細胞的濃度。

1.4細胞分組 正常組(培養128 h)，衰老組(氧化損傷8 h，繼續培養72 h)和松果菊苷組(氧化損傷8 h，松果菊苷用藥繼續培養72 h)。

1.5qRT-PCR TRIzol法提取Leydig 細胞總RNA，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水為對照孔，每孔加入2 μl，設置復孔，用酶標儀進行核酸定量RNA濃度，然后反轉錄成cDNA。三組Leydig細胞的內參均選擇β-actin ，熒光染料(SYBR)進行實時定量檢測。借助統計軟件SPSS19.0，采用 2-△△ct計算方法統計分析三組的Ct值。引物序列：內參β-actin上游引物:CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物:TTTAATGTCACGCACGATTTC；AXLF上游引物:GGTGGCTGTGAAGACGATG，下游引物:CTCAGATACTCCATGCCACT；wnt2b上游引物:GCTGGACCAAACCTGAACG，下游引物:CAAGAAGTATCGGGAAGCA。

1.6MSP 根據細胞基因組DNA快速提取試劑盒，提取各組Leydig細胞DNA，核酸定量DNA濃度，一步法完成DNA樣本變性和亞硫酸鹽轉化，擴增甲基化基因AXL和wnt2b。3 % 瓊脂糖凝膠電泳，借助ChampGel 5000系統自帶Lane1軟件，統計分析三組甲基化百分比。引物序列：wnt2b甲基化上游引物：GGGAAAGTAGTTTAGTTGTTTTTG，甲基化下游引物:AAACTCCTTTAACCACACTACCCTC；wnt2b未甲基化上游引物:CGAGGTGGCAAACATCCTATATTAAG，未甲基化下游引物:CTTTGAAGGCTCCACTCCTGCACACT；AXL甲基化上游引物:AAGTATAAGAGTTTTAACTTAAGGTGGG，甲基化下游引物:ACTTACGCTACACCGTACAAAAA；AXL未甲基化上游引物:GGTGGCTGTGAGTTAGTTGAGACGATG，未甲基化下游引物:CCAAACTCAGATACTCCATGTTCTTCC。

1.7統計分析 應用SPSS19.0軟件行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1MTT 篩選松果菊苷作用濃度結果 當松果菊苷濃度達到 80 μmol/L，無論作用24 h 或 48 h，細胞活力開始下降，320 μmol/L時下降最明顯；松果菊苷作用 72 h 后，不同濃度間細胞活力無差異，其中相同作用濃度，隨著作用時間延長，72 h時細胞活力最好(P<0.05)。綜合而言，72 h時細胞作用濃度為 20 μmol/L時，細胞增殖活力最佳。見表1。

表1 Leydig 細胞的增殖活力

與320 μmol/L比較，1)P<0.05，與160 μmol/L比較：2)P<0.05；與80 μmol/L比較：3)P<0.05

2.2松果菊苷對衰老Leydig細胞AXL基因的影響 衰老組Leydig細胞 AXL mRNA 的表達水平顯著高于正常組，但甲基化水平明顯低于正常組(P<0.05)。松果菊苷用藥后AXL mRNA 表達水平明顯低于衰老組(P<0.05)，但AXL 的甲基化水平與衰老組差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3松果菊苷對衰老Leydig細胞wnt2b基因的影響 衰老組Leydig細胞 wnt2b mRNA 表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，甲基化水平顯著低于正常組(P<0.05)。松果菊苷組用藥后wnt2b甲基化水平明顯升高(P<0.05)，但與衰老組Leydig細胞相比，二者wnt2b mRNA 表達水平無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表2 三組 AXL mRNA 的表達量

與衰老組比較：1)P<0.05，下表同

NG：正常組 AG：衰老組 SGJG：松果菊苷組 nc：陰性對照 M：甲基化 U：未甲基化，圖2同圖1 不同組AXL基因DNA甲基化水平變化

組別mRNA表達水平甲基化百分比(%)正常組0.081±0.0611)0.533±0.0241)衰老組1.000±0.0220.432±0.020松果菊苷組0.870±0.0780.494±0.0101)F值20.45131.449P值0.0000.000

圖2 不同組wnt2b基因DNA甲基化水平變化

3 討 論

H2O2是一種性質穩定易于獲得的強活性氧，常用于短期內氧化損傷誘導的細胞衰老〔2,3〕。de Silva等〔4〕用HaCaT 細胞系研究發現，HaCaT錨定阻滯會引起氧化應激反應，導致DNA損傷，從而引起了全基因組低甲基化趨勢，表明氧化應激改變DNA甲基化從而導致基因組不穩定。Wang等〔5〕研究發現，SD大鼠通過飲用水口服Cr(vi)不僅會引起血漿氧化應激，而且會導致雄性大鼠血細胞的總體DNA低甲基化，并且在丙二醛(MDA)水平升高和總體DNA甲基化降低之間存在良好的相關性。目前，細胞衰老后的一些生物學特征，如形態結構的改變，衰老有關的β-半乳糖苷酶表達，細胞周期停滯在G1期等已經得到較好的闡述〔6〕。然而氧化損傷誘導細胞進入永久停滯狀態的內在甲基化機制尚不清楚。因此，更好地理解老化過程中氧化應激和表觀遺傳相互作用，是確定老化過程關鍵基因改變的重要研究機制之一，對確定有效治療衰老的藥物，在衰老期間改善人類健康及衰老和老年病的研究意義重大。

表觀遺傳學逐漸吸引了越來越多的興趣，因為它已經證明了在不修飾基因序列的情況下調節基因表達的能力，可以積極地影響炎癥和癌癥疾病以及神經退行性疾病的預防和發展過程〔7〕。老化時總的基因組DNA隨機發生低甲基化。轉座因子的DNA序列正常狀態時沉默，DNA甲基化喪失時則可被激活。在不同的年齡段，一些甲基化的改變可以定向發生于基因組的特定區域〔8〕。老化過程中DNA甲基化的部分改變并非是隨機發生的，大多與重復的DNA序列的CpG低甲基化有關〔8,10〕。Leydig細胞可能隨著細胞的衰老，逐漸喪失睪酮合成能力〔11〕。進而推測Leydig 細胞的衰老狀態，可能對男性的生殖功能有影響。

AXL 是受體酪氨酸激酶家族 TAM 受體中(Tyro3，AXL 和 MER)成員之一〔3〕。睪酮替代療法(TRT)部分地通過增強Gas6表達來減輕細胞凋亡。此外，AXL的缺失使睪酮失效，這表明AXL是睪酮的重要下游調節劑。TRT將通過Gas6/ AXL信號通路改善與衰老相關的組織重塑，暗示其治療老化相關疾病的治療潛力〔12〕。本研究說明松果菊苷可以通過抑制衰老的 Leydig 細胞中 AXL mRNA 表達水平，緩解 Leydig 細胞的衰老狀態。

wnt蛋白是一個分泌蛋白家族，調節基因表達、細胞增殖和細胞分化的許多方面〔13〕。wnt/β-catenin信號通路控制著發育和成人生活中的各種生物學現象〔14〕。睪丸中wnt/β-連環蛋白信號特異性促進SSC和祖細胞的增殖〔15〕。也有研究表示wnt2b在附睪頭部高度表達，但在尾部幾乎不存在〔16〕。wnt信號傳導對于小鼠胚胎干細胞等多能性基因的轉錄調節至關重要。盡管如此，wnt信號傳導與表觀遺傳調控機制之間的聯系至今尚未闡明。有研究表明wnt信號作為參與表觀遺傳變化的關鍵參與者的新作用，該信號傳導途徑可以保護沉默基因組區域，并能維持基因組的穩定性〔17〕。研究發現，wnt信號傳導參與睪丸減數分裂前未分化精原細胞的擴增〔18〕。wnt2b的過表達即可導致組織畸形生長，這主要是通過抑制細胞的周期和分化實現的〔19〕。本研究發現了松果菊苷可以通過提高wnt2b甲基化水平，改變Leydig細胞的衰老狀態。