甲氨蝶呤調控鼻咽癌細胞增殖、凋亡和分化的機制

王慧敏 李靜波 王俊杰 陳文明 蔡紀堂

(河南省中醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450000)

鼻咽癌(NPC)是發生于鼻咽腔的惡性腫瘤，其發病率占耳鼻咽喉惡性腫瘤的首位，是我國高發惡性腫瘤之一〔1〕。其發病原因目前尚不十分明確，可能與遺傳、環境、病毒感染等因素有關。目前治療NPC的主要方式是放射治療，但對中晚期患者治療效果并不理想，且放療的毒副作用較大〔2，3〕。因此，尋找新的治療方式成為迫切需要解決的問題。目前通過分子靶向治療成為治療腫瘤的研究熱點，探索NPC增殖、凋亡、分化等生物學特性的可能機制，尋找潛在的分子作用靶點，對NPC的治療和預后具有重要意義〔4〕。甲氨蝶呤(MTX)是一種葉酸類抗腫瘤藥物，在臨床上主要用于乳腺癌、類風濕關節炎、絨毛膜上皮癌、頭頸部腫瘤、肺癌等多種腫瘤疾病〔5，6〕。MTX發揮作用的主要方式是通過抑制二氫葉酸還原酶達到阻礙癌細胞DNA的合成，抑制腫瘤細胞的增殖和生長〔7〕。研究發現，MTX對類風濕關節炎發病過程中的炎性因子白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α具有抑制作用，其作用機制可能是通過與抑制細胞外調節蛋白激酶(ERK)蛋白磷酸化來抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活起到抗炎作用〔8〕。此外，MTX還可通過調控Janus激酶(JAK)-信號轉錄子和轉錄激活子(STAT)信號通路、核轉錄因子(NF)-κB信號通路參與類風濕關節炎發生、發展的過程〔9〕。相關研究發現，Notch信號通路參與NPC細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程〔10〕。本實驗觀察MTX對NPC細胞的增殖、凋亡和分化的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人低分化NPC細胞株CNE-2，人鼻咽部正常上皮細胞株NP69均由河南省中醫院中心實驗室凍存。MTX(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)；細胞計數試劑盒(CCK)-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒(上海古朵生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR Green Gene Expression Assay(大連寶生物工程有限公司)；Cleaved Caspase-3抗體、p53抗體、辣根過氧化物標記的抗體(美國Abcam公司)；Notch1、Notch2蛋白酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.2細胞培養和MTX處理 CNE-2細胞常規復蘇后，接種于體積分數為0.1的胎牛血清的RPMI1640培養基中(含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，NP69細胞復蘇后接種于Defined Keratinocyte-SFM培養液中。將細胞置于37℃、體積分數為5%的CO2，飽和濕度的培養箱中培養，以胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期的CNE-2細胞和NPY69細胞分別接種于96孔板，調整細胞濃度每孔1.5×104個細胞，加入不同濃度MTX培養液，調整終濃度，以不加MTX正常培養的細胞為對照組，每組設置6個復孔，置于恒溫細胞培養箱中繼續培養。

1.3CCK-8法檢測MTX對細胞的影響 各組細胞于37℃、100%濕度培養箱分別培養24 h，每孔細胞中加入10 μl CCK-8，將細胞培養板置于37℃培養箱中，繼續孵育4 h，在酶聯免疫檢測儀于450 nm處檢測各孔細胞吸光度值(A值)，以對照組測得的A值為對照，計算各組細胞增殖抑制率百分比，細胞增殖抑制率=1-(實驗組A值/對照組A值)×100%。實驗重復3次取均值。根據相關標準〔11〕，細胞相對抑制率>50%作為敏感，30%～50%為中度敏感，<30%為不敏感，選擇MTX作用濃度。

1.4流式細胞術檢測NPC細胞凋亡情況 MTX處理24、48 h的NPC細胞，用胰酶消化后收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，4℃2 000 r/min離心5 min，以結合緩沖液重懸細胞，制成單細胞懸液，分別依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，于室溫下避光孵育15 min，加入不少于104個細胞至流式上樣管中，用流式細胞儀檢測各組NPC細胞凋亡率。

1.5Western印跡檢測NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53蛋白的表達 分別收集培養24 h后的各組NPC細胞，按照蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測蛋白濃度。蛋白樣品與電泳緩沖液按照1∶2體積比混勻后，置沸水中加熱5 min使蛋白變性，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠、12%分離膠)分離蛋白，將凝膠蛋白低溫下轉移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫孵育60 min，分別加入相應的一抗Cleaved Caspase-3(1∶800稀釋)、p53(1∶800稀釋)結合，4℃過夜反應，再加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。采用電化學發光，成像系統曝光掃描，以GAPDH為內參，分別以Cleaved Caspase-3、p53灰度值比GAPDH灰度值表示Cleaved Caspase-3、p53蛋白水平，計算各組NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53蛋白表達水平。

1.6定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測NPC細胞中環氧合酶(COX)-2和γ-catenin的表達 各組NPC細胞分別培養24 h以后，用胰酶消化后，低溫低速離心收集細胞，加入1 ml Trizol后震蕩裂解細胞，加入0.2 ml氯仿溶液，震蕩后冰浴5 min，4℃、12 377 r/min離心15 min。棄上清至另一新的EP管中，用預冷的異丙醇沉淀RNA，用75%的乙醇洗滌RNA 3次，用RNase-free ddH2O溶解RNA。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，A260/A280為1.97，可用于后續實驗。用M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Gene Expression Assay進行qRT-PCR，反應體系為20 μl〔cDNA模板4 μl，SYBR Green 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，焦碳酸二乙酯(DEPC)-H2O 4 μl〕。以GAPDH為參照，分別計算COX-2和γ-catenin水平。

1.7ELISA測定細胞培養液上清中Notch1、Notch2含量 各組NPC細胞處理后48 h后，收集細胞培養上清液，按照Notch1、Notch2蛋白ELISA檢測試劑盒說明書檢測培養液上清中Notch1和Notch2含量。

1.8統計學分析 所有實驗至少重復3次，采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗，多組差異單因素方差分析，組間SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1MTX對NPC細胞增殖的影響 不同濃度梯度的MTX(0.0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μmol/L)作用于人NPC細胞及人正常鼻咽部上皮細胞24 h后，NPC細胞和NP69增殖抑制率隨著MTX濃度的增加而升高，呈現出一定的濃度依賴性，差異具有統計學意義(P<0.001)。見表1。提示MTX對NPC細胞增殖具有抑制作用，且呈濃度依賴性，而對人正常的鼻咽上皮細胞增殖抑制作用影響較小。根據藥物敏感性標準選取MTX對NPC細胞的作用濃度分別為5.0、50.0 μmol/L用于后續實驗。

表1 MTX對CNE-2細胞和NP69細胞增殖的抑制率

1)與0.0 μmol/L組比；2)與0.1 μmol/L組比；3)與0.5 μmol/L組比；4)與1.0 μmol/L組比；5)與5.0 μmol/L組比；6)與10.0 μmol/L組比：均P<0.05

2.2MTX對NPC細胞凋亡的影響 NPC細胞經MTX處理24 h后流式細胞檢測結果顯示，處理24 h時5.0、50.0 μmol/L MTX處理的NPC細胞凋亡率分別為(18.52±2.21)%、(41.332±4.53)%，與對照組(0.0 μmol/L MTX)(2.42±0.36)%差異具有統計學意義(P<0.05),提示MTX可誘導NPC細胞凋亡，且呈濃度依賴性。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測MTX對各組NPC細胞凋亡的影響

2.3MTX對NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53蛋白的影響 MTX處理后NPC細胞24 h后，Western印跡檢測NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53的蛋白表達量，0.0、5.0、50.0 μmol/L組NPC細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達水平和p53蛋白表達水平較對照組(0.0 μmol/L MTX)明顯升高(P<0.05)，5.0 μmol/L組與50.0 μmol/L組差異具有統計學意義(P<0.001)。說明MTX可促進NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53的表達，濃度越高Cleaved Caspase-3和p53的表達量越高。見圖2和表2。

圖2 Western印跡檢測各組NPC細胞中Cleaved Caspase-3和p53的表達

MTX濃度(μmol/L)Cleaved Caspase-3p530.00.07±0.010.18±0.025.00.18±0.021)0.32 ±0.031)50.00.92±0.091)2)0.99±0.111)2)F/P值223.640/0.000125.888/0.000

1)與0.0 μmol/L組比；2)與5.0 μmol/L組比：均P<0.05；表3同

2.4MTX對NPC細胞中COX-2和γ-catenin表達的影響 MTX處理NPC細胞24 h后，qRT-PCR法檢測細胞COX-2和γ-catenin mRNA相對表達量，5.0、50.0 μmol/L組NPC細胞中COX-2 mRNA相對表達量分別為0.62±0.07、0.24±0.02，γ-catenin相對表達量分別為0.75±0.08、0.49±0.05，與對照組(0.0 μmol/L)(1.00±0.00、1.00±0.00)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，5.0 μmol/L與50.0 μmol/L組差異具有統計學意義(P<0.05)，3組間差異均顯著(F=245.208，P=0.000；F=65.764，P=0.000)。MTX能夠抑制NPC細胞中COX-2和γ-catenin mRNA的表達，且呈濃度依賴性。

2.5MTX對NPC細胞中培養上清液中Notch1、Notch2含量的影響 與對照組(0.0 μmol/L)相比，5.0、50.0 μmol/L組鼻咽癌細胞Notch1和Notch2含量明顯降低(P<0.05)。5.0和50.0 μmol/L組間差異具有統計學意義(P<0.05)。MTX可抑制NPC細胞Notch1和Notch2的分泌。見表3。

表3 各組細胞培養液上清中Notch1、Notch2含量變化

3 討 論

NPC是起源于咽部隱窩的惡性腫瘤，其發病位置相對比較隱蔽，惡性程度較高，易轉移且容易侵犯鄰近組織，具有區域分布性。目前對NPC治療的主要手段是放射治療，化療和放療對NPC早期患者能夠取得較好的治療效果，但對中晚期NPC患者放療和化療的效果不佳〔12，13〕。MTX是臨床上常用的抗癌藥物，是一種二氫葉酸還原酶抑制劑，屬于代謝類抗腫瘤藥物，可抑制核蛋白的合成，干擾腫瘤細胞DNA的合成從而抑制腫瘤細胞的增生，用于治療惡性腫瘤，其治療效果明顯〔14〕。不同濃度的MTX處理人絨毛膜上皮癌JEG-3細胞后，絨癌細胞生存率下降，酶切的caspase-9蛋白表達水平上調，凋亡增加〔15〕。依西美坦聯合MTX對人乳腺癌MCF-7細胞株產生協同抑制作用〔16〕。本實驗結果顯示，不同濃度MTX處理人NPC細胞和人正常鼻咽上皮細胞后，對NPC細胞增殖抑制作用較明顯，對人正常鼻咽上皮細胞影響作用較小，說明MTX起到抗NPC的作用。

細胞凋亡途徑包括死亡受體途徑和線粒體途徑，兩條細胞凋亡途徑最終執行者都是Caspase-3，導致Caspase-3激活形成有活性的Cleaved Caspase-3，引發一系列后續級聯反應，促使細胞發生凋亡，Cleaved Caspase-3可作為檢測細胞凋亡的標志性物質〔17〕。p53對細胞凋亡具有調控作用，Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，具有促凋亡作用，p53可以上調Bax的表達完成促進細胞凋亡作用。此外，p53還可通過死亡信號受體蛋白途徑誘導凋亡〔18〕。研究顯示，MTX在類風濕關節炎大鼠滑膜細胞中能夠誘導Caspase-3、Caspase-9和Bax蛋白表達上調，導致細胞凋亡〔19〕。采用不同劑量的MTX處理人非小細胞肺癌A549細胞，流式細胞術檢測細胞凋亡率發現，細胞凋亡率顯著升高，對細胞中p53和p21基因檢測結果顯示p53和p21基因表達發生了上調〔20〕。MTX可誘導急性淋巴細胞白血病EU-4細胞凋亡，雷帕霉素預處理可增強MTX誘導的細胞凋亡〔21〕。本研究說明MTX誘導NPC細胞凋亡與Caspase-3的激活及p53的上調密切相關。

COX是一種膜脂蛋白，其中COX-2屬于誘生型，受致癌劑或癌基因產物誘導表達，在結直腸癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤中均有COX-2的高表達。研究表明，COX-2高表達與腫瘤分化相關，COX-2的表達隨甲狀腺病變分化程度不同而改變，從正常上皮到淋巴細胞性甲狀腺炎再到濾泡樣腺瘤及濾泡樣癌COX-2的表達量依次升高〔22〕。低、中、高分化鼻咽癌中COX-2表達量依次降低〔23〕。提示COX-2的表達與分化程度呈負相關。研究指出γ-catenin是構成橋粒的重要組成成分，且橋粒的數量是上皮細胞分化程度的指標之一。此外，γ-catenin的表達與低分子量的細胞角蛋白表達在一定程度上呈正相關。細胞角蛋白是組成細胞骨架的成分之一，其表達量反映細胞的分化程度。因此，γ-catenin的表達量可在一定程度上反映細胞的分化程度。病毒感染引起的NPC通過抑制γ-catenin的表達來抑制NPC細胞的分化程度〔24〕。本實驗結果顯示，MTX誘導的NPC細胞中COX-2和γ-catenin的表達顯著下降，說明MTX可抑制NPC細胞的分化。

Notch信號通路廣泛存在于多種動物體內，在細胞增殖、分化、發育過程中發揮至關重要的作用，研究顯示，Notch信號通路與腫瘤的發生和發展密切相關。在結直腸癌細胞中上調Notch1表達，可使蛋白磷酸激酶B激活，抑制由p53介導的細胞凋亡〔25〕。在不同分化程度的子宮頸癌標本中檢測到Notch1的表達水平不同，提示Notch信號通路與宮頸癌細胞分化有關〔26〕。本實驗提示MTX可通過抑制Notch信號通路的激活調控NPC細胞的增殖、凋亡和分化的過程。

MTX可抑制NPC細胞增殖和分化，促進細胞凋亡的過程，其作用機制與抑制Notch信號通路的激活有關。