不同時間點枸杞多糖灌胃處理對大鼠雙側海綿體神經缺損后腓腸神經移植的修復效應

樂進 李和程

(1西安醫學院第一附屬醫院泌尿外科，陜西 西安 710061；2西安交大第二附屬醫院泌尿外科)

陰莖勃起是一個靠完整神經反射弧支配的生理過程，如果由于各種原因導致與勃起有關的中樞、外周神經損傷即會導致勃起功能障礙(ED)，即神經源性(N)ED。據預測到2025年男性中的1/3將患有不同程度的ED〔1〕，NED是其主要原因〔2〕。研究證實枸杞多糖(LBP)對中樞神經有保護作用，有學者〔3〕在離體實驗中觀察到LBP對體外培養的視網膜神經細胞的生長有保護作用，有學者在高眼壓動物模型中發現LBP對視網膜神經細胞有保護作用〔4〕，而關于LBP對外周神經作用的報道較少。本文旨在進一步研究LBP對大鼠雙側海綿體神經缺損后腓腸神經移植效果。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：SD 雄性大鼠28只，SPF 級，3～4月齡，體重 260～300 g，購自湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2015-0004。于上海大學動物實驗中心 SPF 環境中飼養，自由進水、進食。所有大鼠經性交實驗證實均有正常的性功能。主要試劑：LBP購自上海大學醫學院；0.2%TritonX-100 購自美國 Amresco 公司；甲苯胺藍、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)購自美國 Sigma 公司；戊巴比妥鈉購自德國 MERCK 公司；甲醛、苦味酸、蔗糖、碘伏消毒液購自國藥集團化學有限公司；聚乙二醇及聚乙烯醇混和物(OTC)購自Tissue-Tek 公司；鋨酸購自上海劉氏科技醫藥有限公司；乙醇購自云興化工有限公司；低分子肝素鈉購自深圳市天道醫藥有限公司。

1.2實驗動物分組 術前將28只SD雄性大鼠隨機分成4組各7只，即雙側海綿體神經切斷后自體腓腸神經移植術后第1天開始LBP(10 mg/kg)灌胃持續2 w組(A組)、雙側海綿體神經切斷后自體腓腸神經移植術后第1周開始LBP(10 mg/kg)灌胃持續2 w組(B組)、雙側海綿體神經切斷后自體腓腸神經移植術后第1天開始等量生理鹽水灌胃持續2 w 組(C組)、假手術組(僅分離但不損傷雙側海綿體神經)。

1.3建立動物模型 在無菌條件下，各組SD雄性大鼠用1%的戊巴比妥(50 mg/kg)溶液經2 ml無菌注射器行腹腔注射。待大鼠麻醉成功后，于下腹部備皮，將大鼠四肢呈仰臥位固定于木板上，術區用碘伏溶液消毒，鋪巾，取下腹部正中至陰莖根部切口。在放大10倍的手術顯微鏡(上海醫用儀器廠，SXP-1B型)下，于兩側前列腺背外側方找到海綿體神經和盆神經節。假手術組在找到海綿體神經和盆神經節后，仔細游離雙側海綿體神經，后逐層關腹，縫合傷口。腓腸神經移植并灌胃組均暫時關閉腹腔，于左側外踝后方取腓腸神經，長約20 mm，平均分成兩段，然后將腓腸神經置于無菌生理鹽水中，后縫合外踝傷口。打開腹腔，找到海綿體神經后游離并切斷雙側海綿體神經約5 mm，在手術顯微鏡下將腓腸神經用10-0的無損傷線無張力端吻合于雙側海綿體神經的缺損處，縫合時神經切勿牽拉，吻合部位打結不宜過緊，移植段不能扭曲，移植完畢后逐層關腹。對行神經移植的SD大鼠分別于術后第1天、第1周開始給予LBP(10 mg/kg)灌胃及術后第1天開始等量的生理鹽水灌胃，均持續2 w。造模完成后常規飼養3個月。

1.4陰莖海綿體內壓(ICP)的測定 用紋式鉗將陰莖體分離出來，然后用組織鉗輕輕鉗夾陰莖體，用紋式鉗仔細分離陰莖根部，從陰莖腳處切斷坐骨海綿體肌，暴露陰莖海綿體白膜。設置刺激參數為20 Hz、5.000 V、5.00 ms脈沖，電流持續刺激50 s并記錄ICP值。

1.5海綿體神經的甲苯胺藍染色 找到雙側移植神經干，取離移植神經干遠端2 mm、海綿體神經干約6 mm。在顯微鏡下通過油鏡(×1 000倍)觀察1%的甲苯胺藍染色后整個橫切面軸突的個數。

1.6陰莖海綿體組織NADPH染色后檢測一氧化氮合酶(NOS)陽性神經纖維的數目 用CM1900恒冷箱式冰凍切片機(Leica德國)切片,片厚約10 μm。將切片放置于含有5 mg/ml的NBT、1 mg/ml NADPH、0.2%TritonX-100的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液(pH8.0)中3 h，溫度37℃。用冰PBS溶液沖洗終止反應。顯微鏡放大400倍下觀察陰莖海綿體組織NADPH染色后NOS陽性神經纖維的數目。

1.7統計學分析 采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠海綿體神經缺損腓腸神經移植術后3個月鏡下改變 如圖1所示，顯微鏡下可見移植神經生長良好，有光澤，色灰白，吻合端無離斷，神經無水腫及壞死情況。

2.2各組ICP測定結果 A組ICP明顯低于假手術組(P<0.05)，但顯著高于C組(P<0.05)；B組ICP顯著低于假手術組(P<0.05)，顯著高于C組和A組(P<0.05)。見表1。

圖1 術后3個月移植后的腓腸神經(×10)

2.3各組海綿體神經軸突數目比較 A組軸突數明顯低于假手術組(P<0.05)，但顯著高于C組(P<0.05)；B組軸突數顯著低于假手術組(P<0.05)，顯著高于C組和A組(P<0.05)。見表1、圖2。

2.4各組陰莖海綿體NOS陽性神經纖維數目比較 A組顯著低于假手術組(P<0.05)，但顯著高于C組(P<0.05)；B組顯著低于假手術組(P<0.05)，但顯著高于C組和A組(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組ICP測定結果

與假手術組相比：1)P<0.05；與C組相比：2)P<0.05；與A組相比：3)P<0.05

圖2 各組海綿體神經軸突(甲苯胺藍染色，×1 000)

圖3 各組陰莖海綿體NOS陽性神經纖維(NADPH染色，×400)

3 討 論

陰莖勃起是以海綿體充血腫大為特點的神經血管事件，其過程依賴于神經和體液機制的整合及不同級別神經系統的參與。它要求自主性和軀體神經的參與及整合眾多的脊髓和脊髓上的神經沖動〔5〕。陰莖的勃起是通過腎上腺素能神經末梢釋放神經遞質，去甲腎上腺素等從而激活腎上腺素能受體(尤其是在陰莖小梁肌高表達的α-1腎上腺素受體)來完成的。腎上腺素能受體興奮后能引起陰莖動脈血管平滑肌收縮及陰莖小梁平滑肌收縮，從而導致動脈血流量減少及海綿竇腔隙空間的塌陷，最終導致靜脈充血。內皮素-1是由血管內皮細胞或可能是由小梁平滑肌細胞本身合成的一種強力血管收縮肽，被認為參與了人體海綿體組織的收縮調控。目前已知其他類物質亦參與調控陰莖海綿體的充血腫大：幾種由海綿體組織產生的縮肌類前列腺素(PG)H2、PGF2、血栓素(TX)A2，它們和一氧化氮(NO)同時釋放，從而減輕了NO的擴血管效應；血管緊張素(AT)Ⅱ可能是通過激活AT-Ⅰ型受體而導致陰莖海綿體的收縮效應〔6〕。針對平滑肌細胞的各種特定信號機制將會導致細胞內游離鈣離子濃度增加，從而直接通過Rho-激酶的激活來激活肌球蛋白，最終導致陰莖平滑肌被激活。在陰莖勃起過程中的第一步就是血管擴張，其直接后果就是導致海綿體內血流量的增加及海綿竇內壓力的增加。平滑肌細胞的舒張依賴于內分泌(循環物質)、旁分泌(釋放的遞質來源于內皮細胞和鄰近神經)，也有可能是自分泌(由平滑肌細胞自身合成的物質)。陰莖動脈擴張主要是NO和內皮源性超極化因子(EDHF)起作用，后者主要是通過開放鉀離子通道起到舒張血管的作用〔7〕。NO是一種高活性的自由基，主要由NOS使用L-精氨酸和分子氧來合成。迷走神經由于可釋放NO和乙酰膽堿所以被稱為氮能神經。

NO的釋放可能是通過節后膽堿能神經激活了內皮細胞，或者循環血漿物質如氧或緩激肽的刺激，或更可能的是在勃起過程中由血管及海綿竇擴張過程中產生的切應力導致。一旦產生，NO便擴散到鄰近血管內皮細胞的平滑肌細胞，并和其結合，從而激活鳥苷酸環化酶。此酶催化三磷酸烏苷(GTP)的去磷酸化從而產生去磷酸化的環磷酸鳥苷(cGMP)，cGMP作為第二信使參與了許多重要的細胞功能，特別是產生舒張平滑肌的效應〔8〕。

陰莖接收骶髓副交感神經(骨盆)、胸腰交感神經(下腹和腰椎)和體(陰部)的神經支配。陰莖主要的興奮性傳入神經由副交感神經系統負責，主要是負責陰莖血管的舒張和勃起。節前纖維起源于骶部脊髓(S2-S4)，通過盆腔神經叢到達盆腔。海綿體神經含有副交感神經纖維，是陰莖血管平滑肌傳入神經。陰莖的交感神經節前神經纖維是位于第10胸椎至第2腰椎脊髓節段的神經元。這些纖維在交感神經的脊柱椎旁鏈的神經節的突觸后連接，達到腸系膜和腹下神經叢;產生的腹下神經到達盆腔神經叢，因此泌尿生殖區的交感神經傳出神經主要是由盆神經和陰部神經合成。交感神經系統似乎在抑制陰莖勃起方面發揮了舉足輕重的作用〔9〕。

除了自主神經支配，陰莖也接受軀體傳入神經來自陰莖背側神經(DPN)——陰部神經的感覺支的支配。陰莖的龜頭感覺神經支配是獨一無二的，因其近90%的傳入終端是游離神經末梢。來自陰莖皮膚、包皮及龜頭的傳入性刺激，由陰莖背側神經開始傳遞，并維持促反射性的勃起。接受由觸覺、視覺、幻想和嗅覺的刺激可導致男性勃起，而且該反應是由脊髓中心控制的。這可能是神經反射和心理刺激骶髓副交感神經通路的協調作用〔10〕。目前在脊髓節段以上因素對勃起功能所起的作用知之甚少，而且以往的所有研究基本上是在動物模型的基礎上。下丘腦及大腦邊緣區通路似乎在勃起中發揮了一定作用，尤其是下丘腦內側視前區(MPOA)在勃起調節以外的一些自主性反應如心率增快和皮膚潮紅等性反應起到了協同作用。其他的脊髓中心(即背內側和腹內側核、下丘腦室旁核、腦橋、延髓中縫、藍斑和導水管周圍灰質)及它們的連接邊緣和皮質區也參與到勃起的過程中〔11〕。

本文采用大鼠的腓腸神經作為移植神經干主要是因為腓腸神經方便取材，術后損傷較小，術區的麻木及感覺減退并不影響大鼠正常的行走及活動。本研究說明用腓腸神經移植替代受損的海綿體神經后其神經反射通路是完整的，而LBP的應用促進了其神經發射通路的恢復。由此可見，LBP灌胃對海綿體神經損傷有修復作用，神經因受到機械損傷后，神經膜表面的微血管網受到破壞，缺血再灌注隨后出現，加之血凝塊及炎癥的產生，局部產生大量的自由基〔12,13〕。自由基在體內聚集從而造成脂質過氧化反應使機體的各種組織受到損傷，特別是神經組織的損傷〔14〕，從而影響其再生和功能恢復。在術后第1天大鼠神經離斷吻合后可能是由于創傷，出血致使氧化應激增強，自由基產生較多，且神經離斷后會導致神經元的外漏，而LBP本身有調節免疫的功能，相對抑制了LBP的抗氧化作用，而在術后第1周大鼠神經創傷較前恢復，吻合端神經元外漏減少，氧化應激反應相對較弱，自由基產生相對較少，從而發揮了LBP增強免疫及抗氧化功能，促進神經恢復，具體的分子機制尚不清楚，有待進一步研究。