海藻糖合酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達

王希暉，劉洪玲，隋松森，楊少杰，王瑞明，王騰飛*

1(生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室(LBMP)(齊魯工業大學)，山東 濟南，250353) 2(山東省微生物工程重點實驗室(齊魯工業大學)，山東 濟南，250353) 3(諸城東曉生物科技有限公司，山東 濰坊，261000)

海藻糖[1]是由2個葡萄糖分子通過1,1-糖苷鍵結合而成的非還原性糖，因其特殊的生物學功能和獨特的應用價值，廣泛應用于食品、藥品、農牧業等行業，其發展前景非常廣闊，但生產上的不足導致其應用受到一定程度的限制。當前獲得認可的海藻糖生產工藝是利用海藻糖合酶(trehalose synthase)[2]直接轉化麥芽糖生成海藻糖，但海藻糖合酶的獲取受到限制，影響了海藻糖的生產。

因此，為實現海藻糖合成酶的安全高效表達，安全的宿主菌和高效的轉錄表達系統的選擇是關鍵?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)作為一種革蘭氏陽性菌[3]，由于其自身的非致病特性和分泌外源蛋白能力強的特性，以及有著長期制備發酵食品的歷史，已是公認的一種安全菌株。因此本試驗采用B.subtilisWB800n進行宿主表達，可解決宿主菌自身產內毒素的不安全因素?？莶菅挎邨U菌有多種不同的轉錄表達系統[4]，根據啟動子誘導機制的不同，可分為4種類型，分別是誘導型[5]、自誘導型[6]、時期特異型[7]和組成型[8]啟動子，由于誘導型啟動子是在發酵過程中添加化合物誘導或受環境變化來控制基因轉錄，發酵條件受到限制，另外3種轉錄方式都是非誘導型，發酵過程簡便高效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

惡臭假單胞桿菌KT2440(PseudomonasputidaKT2440)、大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)、枯草芽孢桿菌WB800n (B.subtilisWB800n)菌株，質粒是穿梭表達質粒pHT01。

1.1.2 實驗試劑

pZERO-Blunt零背景平末端快速連接試劑盒、2×Phanta Max Master Mix、2×TaqPCR Master Mix：艾德萊生物科技有限公司；T4 DNA連接酶、限制內切酶：Thermo公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 引物及核苷酸序列

引物通過Oligo 7.0軟件設計，由上海生工生物工程公司合成，其引物序列見表1。測序引物為T7啟動子的通用引物。

表1 質粒構建用引物

1.1.4 培養基

LB培養基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，pH 7.0；

LB固體培養基：在LB培養基中加入質量濃度20 g/L瓊脂粉;

TB培養基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、甘油4 mL/L、KH2PO417 mmol/L、K2HPO472 mmol/L;

優化后TB培養基：胰蛋白胨12 g/L、酵母浸粉24 g/L、蔗糖12g/L、KH2PO46.5 mmol/L、K2HPO427 mmol/L;

GM增殖培養基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L；

RM復蘇培養基：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.38 mol/L；

ETM電轉緩沖液：山梨醇0.5 mol/L、甘露醇0.5 mol/L、海藻糖0.5 mol/L、甘油體積分數10%。

1.2 方法

1.2.1 穿梭表達載體的構建

1.2.1.1 PCR獲得目的基因片段

根據NCBI上報道的PsrfA和4個時期特異性啟動子PabrB、PspoVG、PLytR、PmmgA的基因序列人工合成PsrfA和PabrB-spoVG-LytR-mmgA的基因片段，并對啟動子PsrfA進行了密碼子優化[14]，將PsrfA啟動子的-35區(GTGATA)和-10區(TAAACT)分別改為-35區(TTGACT)和-10區(TATAAT)。

1.2.1.2 pHT01-PsrfA- treS表達載體的構建

以人工合成的PsrfA基因序列為模板，用引物SrfA-F/SrfA-R通過PCR擴增得到長度為606 bp的PsrfA基因片段，以惡臭假單胞桿菌KT2440基因組為模板，用引物TreS-1-F/TreS-R經過PCR擴增得到長度為2 067 bp的treS基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段擴增連接得到長度為2 673 bp的帶有His標簽的PsrfA-treS基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體，送測序公司進行基因測序，測序正確后，采用限制性內切酶BamH I/AatII對pZERO-PsrfA-treS和pHT01雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01-PsrfA-treS重組載體。載體構建流程如圖1所示。

圖1 PHT01-PsrfA-TreS質粒載體的構建

Fig.1 Construction of pHT01-PsrfA-treS plasmid vector

1.2.1.3 pHT01-P43-treS表達載體的構建

以枯草芽孢桿菌基因組為模板，用引物P43-F/P43-TreS-R PCR擴增得到長度445 bp的P43基因片段，在treS基因315 bp處有酶切位點NotI，以構建的pHT01-PsrfA-treS為模板，用引物TreS-P43-F/TreS-1-R PCR擴增得到長度為315 bp的treS-1基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段連接擴增得到長度為760 bp的P43-treS-1基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體送到測序公司進行基因測序，測序正確后，用限制性內切酶BamH I/NotI對pZERO-P43-treS-1和pHT01-PsrfA-treS進行雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01-P43-treS重組載體。

1.2.1.4 pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS表達載體的構建

依據NCBI中公布的啟動子序列，對PabrB-spoVG-LytR-mmgA基因序列進行人工合成后，用引物PabrB-F/PmmgA-TreS-R PCR擴增得到長度1 200 bp的PabrB-spoVG-LytR-mmgA基因片段，在treS基因315 bp處有酶切位點NotI，以構建的pHT01-PsrfA- treS為模板，用引物TreS-mmgA-F/TreS-1-R PCR擴增得到長度為315 bp的treS-1基因片段，再通過重疊PCR的方法將2個片段連接擴增得到長度為1 515 bp的PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1基因片段。將片段連接到pZERO-Blunt平末端載體送到測序公司進行基因測序，測序正確后，限制性內切酶BamH I/NotI對pZERO-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1和載體pHT01-PsrfA-treS進行雙酶切，再用T4連接酶連接得到pHT01- PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS重組載體。

1.2.2 產海藻糖合酶重組枯草芽孢桿菌的構建

1.2.2.1 枯草芽孢桿菌感受態的制備

挑取新鮮的LB固體培養基(添加新霉素抗性)表面的B.subtilisWB800n單菌落，接種于5 mL的LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜；取500 μL上述菌液轉接到50 mL GM增殖培養基中，37 ℃、200 r/min培養至OD600=1.0；將菌液轉移至已滅過菌的100 mL離心管，冰水浴10 min后，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體；用預冷的電轉緩沖液ETM洗滌3～4次，將洗滌后的菌體重懸于500 μL的ETM中，即為枯草芽孢桿菌電轉化感受態細胞[15]；將制備好的感受態細胞分裝為每管60 μL，-80 ℃保存備用。

1.2.2.2 構建重組菌B.subtilisWB800n(pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS)

從-80 ℃冰箱取出3管60 μL的感受態細胞(新制備可直接用，不需要放置冰箱)，分別加入6 μL的質粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS混合均勻，預冷5 min后將混合的菌液加入2 mm的電轉杯(電轉杯需要提前處理：無水乙醇浸泡10 min，然后用吹風機吹干，置于無菌操作臺紫外照射20 min，然后蓋上蓋子，放置冰中預冷)中，用Eppendorf電轉儀在2 000 V、5 ms條件下電擊1次。電轉完畢后，迅速加入1 mL RM復蘇培養基，37 ℃、200 r/min復蘇4 h后，離心重懸后涂布在含氯霉素(40 μg/mL)固體LB培養基，放在37 ℃恒溫培養箱中倒置培養1～2 d，篩選抗氯霉素的菌株。

1.2.2.3 驗證重組菌

挑取上述抗氯霉素菌株的單菌落作為模板，分別通過上下游引物來進行PCR擴增，擴增產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，最終獲得陽性克隆菌株。

1.3 搖瓶培養條件的優化

(1)碳源優化。分別以可溶性淀粉、麩皮、葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖為碳源，進行搖瓶發酵，TB培養基做對照。

(2)碳氮比優化。胰蛋白胨與酵母浸粉的比例分別選擇0∶36、6∶30、12∶24、18∶18、24∶12、30∶6、36∶0，碳源使用優化后的蔗糖，進行搖瓶發酵，TB培養基做對照。

(3)不同發酵溫度對發酵結果的影響。使用優化碳源和氮源的培養基進行搖瓶發酵，溫度分別設置30、33、37、40和45 ℃，驗證發酵溫度對酶活的影響。

(4)培養基初始pH值優化。以優化后的TB培養基作為基本培養基，改變培養基中K2HPO4和KH2PO4的比例，分別調節培養基初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，進行搖瓶發酵。

1.4 5 L發酵罐發酵培養

使用總體積為5 L發酵罐(BLBIO-5GJ)[16]，工作體積為3 L，發酵過程中，溫度維持37 ℃，pH值維持在8.0，(pH值通過滴加10%的氨水來維持)，并且通過對通風量與攪拌速率的控制使溶氧(dissolved oxygen,DO)維持在20%～40%。初始培養基為優化后的TB培養基，另加入40 μg/mL的氯霉素。發酵時間32 h，每隔10、13、16、20、24、28、32 h取樣1次，直至發酵結束。

1.4.1 酶活測定

將在不同發酵時間取出的40 mL菌樣于8 000 r/min離心10 min，棄去上清得到沉淀，用配制好的10 mmol/L pH 8.0 PBS緩沖液重懸，經超聲波破碎得到粗酶液。取5 mL粗酶液與5 mL 60%的麥芽糖溶液混勻，在25 ℃水浴鍋中轉化4 h后,于100 ℃煮沸10 min，滅活，通過液相色譜分析儀測定其轉化的海藻糖含量，并計算出不同發酵時間的每克菌體的酶活。

酶活力單位[17]定義：在酶的最佳酶反應條件下(25 ℃，pH 8.0)，將質量濃度300 g/L麥芽糖轉化為海藻糖，每小時產生1 μmol海藻糖所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.4.2 SDS-PAGE檢測分析

取不同培養條件的發酵液，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，用0.05 mol/L pH 8.0的PBS緩沖液重懸，超聲破碎，加入SDS-PAGE樣品緩沖液后煮沸10 min，樣品進行SDS-PAGE(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%)。電泳結束后凝膠染色4 h然后脫色，將脫色后的凝膠用凝膠成像系統觀察。

2 結果與分析

2.1 重組菌的構建

2.1.1 重組質粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS的構建

通過PCR和重疊PCR技術得到PsrfA-TreS、P43-TreS-1和PabrB-spoVG-LytR-mmgA-TreS-1基因片段，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，在2 700、750和1 500 bp左右出現特異性電泳條帶，如圖2-a、b、c所示，與理論值2 673、760、和1 515 bp相符，表明獲得了PsrfA-TreS、P43-TreS-1和PabrB-spoVG-LytR-mmgA-TreS-1基因片段。將制得的片段連接到表達載體pHT01相應酶切位點，重組載體pHT01-PsrfA-TreS通過限制性內切酶BamH I/AatII對載體進行酶切驗證，載體pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS通過限制性內切酶BamH I/NotI對載體進行酶切驗證，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，在2 700、750和1 500 bp左右出現特異性電泳條帶，如圖2-d、e、f所示，表明表達載體pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS構建成功。

a：M-Maker DL5000；1-PsrfAband；2-treS band；3-PsrfA-treS band;b：M-Maker DL5000；1-P43band；2-treS-1 band；3-P43-treS-1 band;c：M-Maker DL5000；1-PabrB-spoVG-LytR-mmgAband；2-treS-1 band；3-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1 band;d：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-PsrfA-treS; 2-pHT01-PsrfA-treS;e：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-P43-treS; 2-pHT01-PsrfA-treS;f：M-Maker DL5000; 1-Double enzyme digestion of pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS; 2-pHT01- PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS圖2 基因的PCR擴增電泳圖和重組表達質粒的酶切驗證圖

Fig.2 PCR amplified electrophoresis and restrictionenzyme digestion identifieation of recombinant plasmid

2.1.2 重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS的構建

提取質粒pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS，并用核酸超微量分光光度計(BioFuture MD2000)測DNA質量濃度，結果顯示，DNA質量濃度為220 ng/μL左右。將6 μL提取的質粒與60 μLB.subtilisWB800n感受態細胞[18]混合并進行電轉化，分別使用上下游引物SrfA-F/TreS-1-R、P43-F/TreS-1-R和PabrB-F/TreS-1-R對陽性克隆子進行PCR驗證，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，在1 000、750和1 500 bp左右出現特異性電泳條帶，如圖3-a、b、c所示，與理論值921、760、和1 515 bp相符，表明質粒載體pHT01-PsrfA-treS、pHT01-P43-treS和pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS成功轉化到B.subtilisWB800n中，并獲得了陽性克隆菌株。

a: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-PsrfA-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-PsrfA-treS-1 fragment electrophoretic diagram;b: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-P43-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-P43-treS-1 fragment electrophoretic diagram;c: M-Maker AL5000;1-positive control plasmid pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS; 2-negative control B.subtilis WB800n; 3～8-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS-1 fragment electrophoretic diagram圖3 重組菌的菌落PCR驗證圖

Fig.3 Colony PCR validation of recombinant bacterial

2.2 啟動子的篩選

將構建成功的重組菌枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS分別接種到LB培養基中，發酵培養分析不同啟動子重組菌的單位菌體酶活，結果如圖4所示，3個重組菌均能在胞內表達海藻糖合酶，而且隨著發酵時間的延長，單位菌體酶活呈現先增加后降低的趨勢。發酵過程中組成型啟動子P43啟動子表現出較高的酶活，其次是4個時期特異性串聯啟動子PabrB-spoVG-LytR-mmgA，最后是PsrfA啟動子。P43啟動子表達的酶活最高達到約2 167 U/g，這說明P43啟動子的啟動強度最大，較不同時期特異性啟動子串聯特性強，而PsrfA啟動子是群體密度依賴型啟動子[19]，其表達酶活的時間延遲，這主要是因為在密度低時，啟動子的啟動強度受到限制。

圖4 胞內表達TreS重組菌LB培養基酶活

Fig.4 Intracellular TreS enzyme activity of recombinant bacteria in LB medium

為了進一步驗證3個啟動子的酶活特性,將3個重組菌接種至更利于外源酶表達的TB培養基中進行發酵培養，結果如圖5所示。菌體表達的總酶活均有明顯增加，P43調控的重組菌最高酶活達到3 481 U/g，但3個啟動子的表達酶活依然遵循LB培養基相同的情況，亦在發酵的后期，酶活下降迅速，這主要由2個原因造成，一是后期菌體為了維持生長，對表達的外源酶進行降解；二是發酵后期，因為營養的逐漸匱乏，多數菌體產生芽孢，造成酶的降解。

圖5 胞內表達TreS重組菌TB培養基酶活

Fig.5 Intracellular TreS enzyme activity of recombinant bacteria in TB medium

2.3 搖瓶發酵條件優化

2.3.1 碳源優化

以TB培養基作為基本培養基[20]，改變TB培養基中的碳源組分，將重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS在500 mL含有100 mL不同碳源的TB培養基中進行發酵酶活分析。在37 ℃，200 r/min下搖瓶發酵培養24 h。分析不同碳源對發酵酶活的影響，從圖6、圖7可以看出，不同碳源對發酵酶活有不同的影響，以蔗糖為碳源時酶活達到5 763 U/g，明顯高于其他碳源。對蔗糖的添加量進行了優化，最終得出，添加12 g/L蔗糖酶活最高。

圖6 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的不同碳源比較

Fig.6 Different carbon source comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

圖7 B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS的不同蔗糖質量濃度比較

Fig.7 Different sucrose concentration comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS

2.3.2 氮源優化

氮源是微生物生長的必要元素，同時在發酵過程中也是增加成本的因素之一[21]，因此，有必要分析氮源對發酵酶活的影響。在上述優化后的TB培養基中，改變其中的胰蛋白胨與酵母浸粉的比例，在37 ℃，200 r/min下搖瓶發酵培養24 h，驗證不同比例的2種氮源對發酵液酶活的影響，如圖8所示，原有的胰蛋白胨∶酵母浸粉比例為12∶24時對酶活的影響具有明顯的優勢，因此維持原有的比例成分不變。

圖8 B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS的不同氮源比例的比較

Fig.8 Different nitrogen sources ratio comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43- treS

2.3.3 發酵溫度對酶活的影響

對原始TB培養基的主要成分進行適當優化后，進一步分析發酵溫度對產酶的影響。重組菌先在37 ℃，200 r/min條件下培養8 h，然后改變培養溫度。從圖9可以看出，37 ℃為最佳溫度，溫度過高過低都不利于海藻糖合酶的表達。

圖9 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的發酵溫度的比較

Fig.9 Different fermentation temperatures comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

2.3.4 發酵pH值對產酶的影響

對培養基的主要成分進行適當優化后，進一步分析不同發酵pH值對產酶的影響，以不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液配制發酵培養基，在37 ℃，200 r/min下搖瓶發酵培養24 h，發酵液酶活如圖10所示。

圖10 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS的發酵pH值的比較

Fig.10 Different fermentation pH comparison of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS

結果表明,在pH 7.0～8.0總酶活相對較高，pH 8.0時，總酶活最高，且此時的菌體干重亦有明顯優勢。

2.4 發酵罐放大發酵培養

為進一步探討產酶穩定性，將重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS在裝有優化后TB培養基的5 L發酵罐中進行發酵驗證，發酵罐總裝液量為3 L，轉速500 r/min，通風量0.3 vvm，溫度37 ℃，初始pH值7.0，發酵前8 h發酵液pH值緩慢上升至8.0，之后通過滴加NaOH維持pH值穩定在8.0。發酵結果如圖11所示，結果表明，TreS的表達量仍然是P43>PabrB-spoVG-LytR-mmgA>PsrfA。

圖11 胞內表達TreS重組菌的5 L發酵罐酶活

Fig.11 Enzyme activity of recombinant bacteria in 5 L fermentor

2.5 SDS -PAGE凝膠分析

不同發酵時間取出的樣品經超聲破碎后做蛋白電泳，由圖12可以明顯看出，在75 kDa處有明顯的條帶，與海藻糖合酶75.634 kDa理論值[22]相符，說明海藻糖合酶基因在重組菌中成功表達。

M-Marker;1-B.subtilis WB800n;2～9-10,13,16,20,24,28,32 h圖12 B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS在5 L發酵罐中菌體破碎液SDS-PAGE分析

Fig.12 SDS-PAGE analysis of B.subtilis WB800n/pHT01-P43-treS in 5 L fermentor

3 結論

本研究基于海藻糖合成酶在生產上的不足導致其應用受到一定程度的限制，本試驗通過基因改造的手段，利用枯草芽孢桿菌的非誘導表達系統構建了海藻糖合成酶在安全菌株枯草芽孢桿菌中的高效表達系統[23]。本研究分別將單啟動子和多啟動子與海藻糖合成酶基因融合后構建到大腸-枯草穿梭質粒pHT01[24]上，通過電轉化方法轉化到枯草芽孢桿菌感受態細胞中，得到了重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-PsrfA-treS、B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS和B.subtilisWB800n/pHT01-PabrB-spoVG-LytR-mmgA-treS。通過利用基礎LB、TB培養基初步驗證重組菌的酶活，驗證3種啟動子的轉錄強度，篩選得到強度最高的啟動子P43，得到高效表達海藻糖合酶的重組菌B.subtilisWB800n/pHT01-P43-treS，并對此重組菌進行發酵優化，進一步提高了海藻糖合酶的表達量，成功構建了自誘導表達海藻糖合成酶的安全高效表達系統，為后續制備食品級的酶制劑[25]奠定了基礎。