響應面法優化牡蠣多肽酶解工藝的研究

陳弘培 ，劉藝琳 ，龔世禹 ， 劉 斌 ，3， 曾 峰

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.福建農林大學海洋研究中心，福建福州 350002；3.福建農林大學國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002）

隨著社會的發展，海洋中蘊藏的對人類健康有益的生物活性物質或功能性成分逐漸受到研究者的關注。海洋生物已成為發現新型生物活性成分和研究功能性食品的重要來源。牡蠣又稱為生蠔，屬于軟體動物門、瓣鰓綱、異柱目、牡蠣科，是世界第一大養殖貝類，也是我國四大養殖貝類之一。牡蠣是一種高營養的海洋動物[1]，同時也是藥食同源的保健品[2]。牡蠣（Oyster），被譽為“海洋里的牛奶”，富含蛋白質和對人體重要的鋅元素。牡蠣體內含糖原[3]，10種人體必需的氨基酸，?；撬岷坑绕湄S富[4]。牡蠣中含有 Cu，Zn，Mn，Ba，P，Ca等無機物，研究發現牡蠣具有抗腫瘤、降血壓、護肝、抗氧化、抗疲勞、抗病毒、抑菌等功能。

當今世界對食品多肽的研究日益重視，不僅因其具有較高安全性，相對于蛋白質，多肽更易被人體吸收利用。此外大多數多肽具有抗氧化等功能。因此，在功能保健食品方面將具有發展前景。郭溆等人[5]利用黃秋葵籽粕蛋白，采用酶解法獲得具有抗氧化活性的多肽。徐浩等人[6]制備了河蜆酶解液，發現分子量小于5 kDa的抗氧化活性最高。蘆鑫等人[7]發現堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白表現出較強抗氧化的水平。試驗通過響應面優化設計，對牡蠣多肽的酶解工藝進行了研究，以提高牡蠣多肽的利用，為牡蠣的綜合利用提供了新思路。

1 材料與儀器

1.1 原料

牡蠣（Oyster），購于福州市金山大潤發超市，敷冰運回實驗室后，將新鮮牡蠣洗凈，經高速組織勻漿機斬拌均勻，于-20℃下冷凍備用；中性蛋白酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶 （1.0×105U/g）、風味蛋白酶 （1.0×105U/g）、胰蛋白酶 （2.5×105U/g），購于北京索萊寶科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），購于上海源葉生物有限公司；牛血清蛋白，購于美國Sigma公司；其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器

SHA-B型水浴搖床，金壇市精達儀器制造有限公司產品；MINI8-UV型超純水機，湖南科爾頓水務有限公司產品；pH值計；MIKRO220R型高速冷凍離心機，Andreas Hettich GmbH&Co.KG產品；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；C21-SH2140型電磁爐（美的）；61010-1:2ND型冷凍干燥機，Kansascity，missouri產品；SpectraMax i3型酶標儀，Molecullar debices產品；BL25B31型攪拌機，廣東美的生活電器制造有限公司產品。

2 試驗方法

2.1 牡蠣基本組成及氨基酸分析

水分測定：GB 5009.3—2016；灰分測定：GB 5009.4—2016；蛋白質含量測定：GB 5009.5—2016；脂肪測定：GB 5009.6—2016；氨基酸的分析：GB 5009.124—2016。

2.2 不同蛋白酶的酶解度、氮素回收率和抗氧化活性的影響

稱取適量牡蠣肉糜按照料液比為1∶6加入超純水，在各蛋白酶最適溫度的恒溫水浴中均勻攪拌，保溫一段時間，調節pH值至最適值，每克肉糜中加入1 000 U活力的酶，時間為5 h。

牡蠣肉糜的酶解參數見表1。

表1 牡蠣肉糜的酶解參數

每隔1 h取酶解液高溫滅酶，直至結束。調節酶解液pH值至7，低溫高速離心，收集上清液冷凍，測定指標。

2.2.1 酶解度的測定

參照王雪芹等人的方法[8]。

2.2.2 氮素回收率的測定

參照王雪芹等人的方法。

2.2.3 牡蠣酶解液清除DPPH·活性

參照Hua D等人[9]的方法。

2.3 牡蠣多肽制備單因素試驗

根據2.2的結果選酶。以加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH值和料液比為因素，DPPH·清除率來評定單因素的最適條件。

2.4 響應面優化牡蠣酶解液的酶解工藝

使用Design Expert 8.0軟件對牡蠣抗氧化條件進行優化，并測定優化后的DPPH·清除率。

3 結果與分析

3.1 牡蠣基本組成及氨基酸分析

牡蠣的一般營養成分見表2。

表2 牡蠣的一般營養成分/%

由表2可知，牡蠣是一種高蛋白質、低脂肪的食品材料。高脂肪的物質在酶解中產生不良風味，影響保質期。一般情況下在酶解前會去除材料中所含的脂肪。不過此做法會增加生產成本，此外除脂肪的過程中殘留的試劑，可能導致蛋白質部分變性，造成食品安全隱患。而牡蠣高蛋白、低脂肪的原料特點，使得它非常適于作為酶解底物，且無需進行脫脂處理。

牡蠣中必需氨基酸的含量為35.35%，牡蠣中鮮味氨基酸的含量為45.42%。支鏈氨基酸含量達14.88%，能夠合成蛋白質，在一些時期還可提供能量[10]，以及改善運動對心肌的代謝[11]。牡蠣中幾種關鍵抗氧化氨基酸（His，Tyr，Met）占10.70%，說明其具有潛在的抗氧化活性。

牡蠣肉糜組分的氨基酸組成分析見表3。

3.2 牡蠣多肽制備單因素試驗

牡蠣肉糜各蛋白酶酶解產物的活性見圖1，不同蛋白酶對牡蠣DPPH·清除率的測定見圖2。

由圖1可知，酶解度在4 h達到一個最大值，在5 h則開始下降，氮素回收率在4 h也較高。故測定酶解時間為4 h時的DPPH·的清除能力。4 h時，4種蛋白酶的酶解度達到最大值，氮素回收率也較高，中性蛋白酶的效果較高。因此，以中性蛋白酶作為最佳用酶。

3.2.1 加酶量

其他4個因素不變的情況下，中性蛋白酶加酶量的條件分別為1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 U/g。

加酶量對DPPH·清除率的影響見圖3。

表3 牡蠣肉糜組分的氨基酸組成分析

在一定范圍內，DPPH·清除率隨著加酶量的增多先上升后下降，加酶量1 400 U/g達到最高值71.82%，若加酶量過低，則會導致底物酶解不徹底，若加酶量過多，會改變酶解液的顏色，產生不良氣味。所以選1 400 U/g為最適加酶量。

3.2.2 pH值影響

其他4個因素不變的情況下，pH值的條件分別為 6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。

pH值對DPPH·清除率的影響見圖4。

在pH值為7.0的時候達到最大值70.52%，由此得出在酸堿環境下都會影響其抗氧化活性，此外調節pH值也不利于后期的樣品處理。所以選擇pH值為7.0。

3.2.3 酶解溫度

其他4個因素不變的情況下，酶解溫度的條件分別為40，45，50，55，60℃。

酶解溫度對DPPH·清除率的影響見圖5。

酶解液在50℃時，DPPH清除率最高，為65.41%，溫度過低則蛋白酶的活性無法完全體現，而高溫會導致蛋白酶失活，所以選擇50℃為溫度。

3.2.4 酶解時間

其他4個因素不變的情況下，酶解時間的條件分別為 3，4，5，6，7 h。

圖1 牡蠣肉糜各蛋白酶酶解產物的活性

酶解時間對DPPH·清除率的影響見圖6。

酶解時間為4 h時，DPPH·清除率達到最高值66.10%，之后開始下降。倘若酶解時間過短，則底物無法完全水解，酶解時間過長，其風味將發生改變，制備成本變高。所以選擇4 h為酶解時間。

3.2.5 料液比

其他4個因素不變的情況下，料液比為1∶3，1∶6，1∶10，1∶15，1∶20。

料液比對DPPH·清除率的影響見圖7。

當料液比為1∶10，DPPH清除率達到最大值68.98%，在適宜條件下，增加料液比可促進蛋白酶催化，但料液比過大時，導致蛋白酶濃度下降。所以選擇料液比為10∶1。

圖2 不同蛋白酶對牡蠣DPPH·清除率的測定

圖3 加酶量對DPPH·清除率的影響

圖4 pH值對DPPH·清除率的影響

圖5 酶解溫度對DPPH·清除率的影響

圖6 酶解時間對DPPH·清除率的影響

圖7 料液比對DPPH·清除率的影響

牡蠣酶解產物的各因素最優條件見表4。

表4 牡蠣酶解產物的各因素最優條件

3.3 牡蠣多肽制備的響應面優化試驗

3.3.1 響應面優化試驗因素水平的選取

在單因素水平上，對pH值、料液比和酶解時間進行三因素三水平優化。

響應面分析法因素與水平設計見表5，響應面試驗設計及結果見表6。

表5 響應面分析法因素與水平設計

表6 響應面試驗設計及結果

根據表6試驗結果得到二次回歸方程（1）：

清除率=75.17+1.35A+1.16B+2.06C-0.82AB-

1.31 AC+0.70BC-3.00A2-1.57B2-2.74C2.

其中A，B，C分別代表pH值、料液比和酶解時間。

響應面試驗方差分析見表7。

表7 響應面試驗方差分析

3.3.2 響應面優化實驗作圖分析

pH值和料液比對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響見圖8。

圖8 pH值和料液比對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響

由圖8可知，料液比和pH值的相互作用不明顯，方差分析結果也表示作用不明顯。pH值恒定時，料液比的增加，DPPH·清除率先上升后下降，不過改變不明顯，料液比恒定時，DPPH·清除率隨著pH值的提高，先增大后減小，變化明顯，在7.0時清除率最大。

pH值和酶解時間對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響見圖9。

pH值為7.0時，隨著酶解時間的延長，其DPPH·清除率先上升后下降，3 h和5 h時DPPH·清除率最低，而在4 h時DPPH·清除率最大。酶解時間特定時，DPPH·清除率隨pH值的升高也出現相同的變化。

酶解時間和料液比對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響見圖10。

圖9 p H值和酶解時間對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響

圖10 酶解時間和料液比對牡蠣酶解產物的DPPH·清除率影響

由圖10可知，在酶解時間恒定時，隨著料液比的增加，DPPH·清除率先上升隨后下降，在料液比為1∶10時達到最高，從圖10可知料液比對DPPH·清除率的影響非常顯著。

3.3.3 響應面法驗證性試驗

通過Design Expert軟件優化后進行分析，測定牡蠣酶解液最高DPPH·清除率，其條件為pH值7.08，酶解時間4.34 h，料液比1∶11.84。預計清除率75.84%，在此條件下進行了驗證，結果發現優化后清除率為74.43%±0.32%，實際清除率和預計清除率無差異性（p＞0.05），擬合度較好。

4 結論

以牡蠣為研究對象，在中性蛋白酶酶解制備牡蠣多肽的的試驗中，綜合考慮了酶解度、氮素回收率和DPPH·清除率等因素。發現加酶量、酶解時間、料液比、pH值、酶解溫度對DPPH·清除率具有一定影響。在單因素試驗的基礎上，以DPPH·為優化指標，采用響應面法優化制備工藝。當酶解溫度50℃，pH值7.0，酶解時間4 h，料液比1∶10，加酶量1 400 U/g，優化后DPPH·清除率達到74.43%。