絲膠對2型糖尿病大鼠胰腺Akt的調節作用*

劉東慧，劉陳霏，宋妤軒，阮鴻嬌，陳志宏△

（1.承德醫學院人體解剖學教研室，河北承德 067000；2.中國藥科大學）

2型糖尿病是一種由胰島素相對或絕對分泌不足導致的以血糖升高為主要臨床表現的代謝性疾病。在胰腺，胰島素由胰島β細胞分泌后與胰島素受體(insulin receptor，IR)結合而啟動磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phos-phatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，啟動后的PI3K/Akt信號通路通過調控胰島素分泌，維持β細胞的生長、增殖等途徑來實現胰島素降低血糖的作用[1-2]。絲膠是從蠶繭中提取的一種天然水溶性蛋白，具有生物相容性，可降解。Akt作為PI3K/Akt信號通路中的關鍵因子之一，本研究在前期發現絲膠能有效降低血糖的基礎上[3]，進一步觀察了絲膠對2型糖尿病大鼠模型胰腺Akt mRNA表達的調節作用，以期揭示絲膠降血糖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 絲膠的提取 蠶繭經1%的Na2CO3浸泡30min后沸煮3h(2次)，將提取液濃縮、透析凍干至粉末備用。

1.2 動物分組及處理 SPF級雄性SD大鼠，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。36只大鼠隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組12只。給予造模大鼠高脂高糖飼料+腹腔注射STZ(35mg/kg/d，連續2d)處理，以空腹血糖≥11.1mmol/L的大鼠為成功2型糖尿病大鼠模型。成模后，實驗組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)連續灌胃35d，正常組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水連續灌胃35d。用藥結束，將各組大鼠麻醉后，取血、處死，迅速取出胰腺加入Trizol放于液氮中研磨，研磨充分后放液氮中儲存備用。

1.3 檢測血糖 將取得的各組大鼠血液標本離心、分離血清后送承德醫學院附屬醫院檢驗科檢測血糖。

1.4 檢測胰腺Akt mRNA的表達 采用Real Time Q-PCR法：取適量胰腺組織提取總RNA并反轉錄為cDNA備用。利用pGM-T質粒載體成功構建Akt和GAPDH標準品后測定其濃度用以后續定量。擴增各組大鼠的Akt和GAPDH得標準曲線、擴增曲線、溶解曲線，PCR引物設計與合成由寶生物工程(大連)有限公司完成，以Akt與相應GAPDH拷貝數的比值作為各組大鼠Akt mRNA的相對表達水平，PCR引物序列見表1。

表1 引物序列和產物大小

1.5 統計分析 各組大鼠血糖及胰腺Akt mRNA的表達均以（±s）表示，采用IBM SPSS Statistics 24.0統計學軟件處理數據，多組間差異的比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異采用Tukey’s檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血糖水平 模型組大鼠血糖明顯高于正常組大鼠(P＜0.05)，實驗組大鼠血糖明顯低于模型組大鼠(P＜0.05)。見表2：

表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達水平（±s ）

表2 各組大鼠的血糖及胰腺Akt mRNA的表達水平（±s ）

與模型組比較：*P＜0.05

組別 n 血糖(mmol/L) Akt mRNA正常組 12 10.83±2.03* 58.14±16.39*模型組 12 29.45±4.82 28.83±8.06實驗組 12 13.20±4.09* 46.37±12.57*

2.2 胰腺Akt mRNA的表達 Akt標準品濃度梯度為1.57×107～1.57×104，以pGM-T-Akt陽性質粒DNA和各組大鼠cDNA做為模板，經過Real Time Q-PCR法擴增后得到的標準曲線擴增效率為94.859%，斜率為-3.452，相關系數r為-0.998，截距為36.253；擴增曲線均呈S型；溶解曲線呈單峰（附圖）。各組大鼠Akt mRNA表達的定量分析結果見表2：模型組大鼠Akt mRNA的表達量明顯低于正常組大鼠(P＜0.05)，實驗組大鼠Akt mRNA的表達量明顯高于模型組大鼠(P＜0.05)。

（1.標準曲線，2.擴增曲線，3.溶解曲線）

3 討論

目前，2型糖尿病的發病率逐年增高，已經成為全球關注的公共健康問題，臨床用于治療糖尿病的各類藥物雖能有效降低血糖，但長期服用均會產生不良反應。因此，探尋一種天然藥物來彌補目前降糖藥的不足十分必要。絲膠來源于蠶繭，課題組前期發現絲膠能有效降低血糖[3]，但機制尚不明了。

胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，與IR結合后啟動PI3K/Akt信號通路，從而激活Akt?；罨腁kt通過調控與細胞周期相關的酶來維持胰島β細胞的細胞周期，促進β細胞增殖[4-5]；活化的Akt可使凋亡基因失活，抑制β細胞凋亡[6]；活化的Akt還可調節β細胞分泌胰島素，促進外周靶組織攝取葡萄糖，減輕胰島素抵抗[7]。有研究發現，Akt激酶失活的轉基因小鼠，其胰島β細胞Akt活性明顯下降，進而出現胰島素分泌缺陷[8]。因此，在胰島β細胞的生長、增殖、再生、凋亡及分泌胰島素中，PI3K/Akt信號通路發揮著十分重要的作用。

本研究發現，模型組大鼠胰腺Akt mRNA的表達明顯降低。Akt是PI3K/Akt信號通路中的關鍵因子之一，其表達降低可通過影響β細胞的增殖、凋亡及胰島素的分泌而導致胰島素的生理作用減弱，從而引發模型組大鼠血糖明顯升高。實驗組大鼠給予絲膠灌胃后，Akt mRNA的表達明顯升高，提示絲膠可通過上調胰腺Akt mRNA的表達，改善糖尿病時胰島β細胞中PI3K/Akt信號轉導通路的異常，從而發揮降低血糖的作用，這可能是絲膠降低血糖的作用機制之一。