維甲酸對胎鼠骨骼致畸作用的研究

韓繼衛, 李秋霞, 夏 鵬, 孫 苗, 王冰烴, 鄭大恒

紹興文理學院生命科學學院, 浙江 紹興 312000

維生素A(vitamin A)又稱視黃醇，是脊椎動物胚胎時期細胞增殖、生長和分化的重要信號分子。動物通過食物攝入維生素A，并經過兩步脫氫氧化為維甲酸(retinoic acid，RA)，維甲酸在生物體內異構酶的作用下以全反式維甲酸 (alltrans retinoic acid, ATRA)和順式維甲酸 (cis-retinoic acid, cis-RA)的形式存在[1,2]。研究表明，全反式維甲酸能夠誘導成骨細胞、骨髓基質細胞、干細胞等細胞的分化以及骨代謝相關基因的表達，參與骨骼的發育與代謝[3]。當其缺乏時，它會破壞成骨細胞與破骨細胞之間的平衡，引起骨質增殖或骨質不吸收，孕婦如果缺乏維甲酸會直接影響胎兒發育，甚至發生死胎[4]。然而在1953年，Cohlan[5]報道了孕鼠攝入過多維生素A導致胎鼠露腦等多種畸形。隨后的實驗研究也證實，過量的維甲酸對脊椎動物以及胎兒有致畸作用[6～8]。已有研究發現不同劑量的維甲酸對小鼠胎鼠的致畸效果不同[9,10]。然而關于不同孕期維甲酸誘導的胎鼠畸形的機理研究較少，且不同的學者對于維甲酸引起骨骼畸形的代謝機理觀點不盡一致，因此本文探究了不同劑量、不同孕期維甲酸對小鼠胚胎生長發育的影響，并試圖從基因層面初步探究維甲酸的致畸機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠購于浙江省實驗動物中心，經飼養觀察3 d后用于實驗；實驗動物實驗程序按本校實驗動物倫理規范(2013051201)執行。

1.2 主要試劑與儀器

全反式維甲酸購于上海第六制藥廠，批號 01007；阿利新藍、茜素紅購于Amresco公司； RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購于Bio-Rad公司；橄欖油購于中糧集團；甘油、丙酮等購于國藥集團，分析純。

主要儀器：體式顯微鏡(Nikon，日本)；臺式高速低溫離心機(Sigma，德國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 方法

1.3.1維甲酸對胎鼠的致畸作用 ①不同劑量的維甲酸對胎鼠的致畸作用。取孕鼠16只，隨機分成4組，設置3個實驗組(ATRA-橄欖油懸液，灌胃)和1個溶劑對照組(橄欖油，灌胃)。實驗組在小鼠妊娠11.5 d 分別灌胃10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的ATRA-橄欖油懸液。在懷孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并測定相關指標。

②維甲酸對不同孕期的小鼠胚胎的致畸作用。取孕鼠16只，隨機分成4組，設置3個實驗組(ATRA-橄欖油懸液，灌胃)和1個溶劑對照組(橄欖油，灌胃)。實驗組分別在小鼠懷孕的7.5 d、11.5 d 和 15.5 d 以50 mg/kg的劑量灌胃ATRA-橄欖油懸液。在懷孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并測定相關指標。

1.3.2胎鼠骨骼染色 取胎鼠，95%酒精固定45 min，去除全身皮膚、皮下脂肪、內臟，重新置于95%酒精中固定36 h。然后置于丙酮中脫脂36 h，將脫脂后的標本分別置于0.017%茜素紅、0.025%阿利新藍中，37℃各染色1 d。將染色后的骨骼置于20%甘油中平衡1 h，再置于20%甘油與1% KOH混合的透明液中透明3 d。標本保存于20%甘油中[11,12]，體式顯微鏡下觀察骨骼發育情況，測量骨骼長度。

1.3.3胎鼠的RNA提取與RT-PCR 按照試劑盒提取胎鼠總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量擴增。PCR的反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個循環。以GAPDH(上游引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′)為內參基因，分析Cyp26b1(上游引物：5′-CTGGCTGCTACAGGGTTCTG-3′，下游引物：5′-CTCGCCCATGAGGATCTTGC-3′)基因的表達水平。

2 結果與分析

2.1 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢骨骼發育的影響

2.1.1不同劑量維甲酸對胎鼠四肢長骨發育的影響 由圖1可見，在懷孕第11.5 d灌胃不同劑量的維甲酸對小鼠體內胎鼠的致畸作用主要表現在四肢骨骼上。胎鼠四肢長骨均普遍短于對照組，并且隨維甲酸劑量的升高不斷縮短(圖1A)，這說明維甲酸對小鼠四肢骨骼發育有抑制作用。并且維甲酸對胎鼠長骨的成骨部分抑制影響尤為劇烈，隨著維甲酸劑量的升高，四肢長骨的成骨部分縮短明顯(圖1A、B)。在維甲酸作用下，小鼠的橈骨、尺骨、股骨、脛骨、腓骨均表現出成骨骨化缺失(圖1B、C)，這表明維甲酸對胎鼠四肢骨骼發育的抑制作用主要影響骨骼的骨化過程。

2.1.2維甲酸對胎鼠四肢手(足)骨發育的影響

由圖2可見，在懷孕第11.5 d灌胃不同劑量的維甲酸，對小鼠四肢手(足)骨發育的統計，手指骨和足趾骨影響較大(圖2B)，伴隨著維甲酸作用劑量的上升，胎鼠指(趾)骨的分化逐漸減弱(圖2A)，當灌胃量達到50 mg/kg以上時，出現少指(趾)、并趾、跗骨縮短甚至愈合的現象(圖2B)，這說明在孕期11.5 d，一定劑量的維甲酸可以干擾骨骼的分化。

圖1 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢長骨發育的影響Fig.1 The effects of different doses of ATRA on long bone of limbs in fetal rat.A.不同劑量維甲酸作用下小鼠整體骨骼、四肢骨骼染色圖(1為肱骨，2為橈骨和尺骨，3為股骨，4為脛骨和腓骨，紅色代表成骨，藍色代表軟骨)；B.不同劑量維甲酸作用下小鼠長骨(肱骨、橈骨、尺骨)的成骨長度；C.不同劑量維甲酸作用下小鼠長骨(股骨、脛骨、腓骨)的成骨長度。*與**表示，對照組相比在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

圖2 不同劑量維甲酸對胎鼠四肢指(趾)骨發育的影響Fig.2 The effects of different doses of ATRA on bone of fingers and toes in fetal rat.A．畸形趾骨(1為少趾，2為并趾，3為跗骨縮短或愈合)；B. 不同灌胃劑量對胎鼠指(趾)數的影響；C. 不同灌胃劑量對胎鼠跗骨長的影響。**表示與對照組(0 mg/kg組)相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.2 維甲酸對不同孕期胎鼠骨骼發育的影響

由圖3可見，在小鼠的不同孕期，維甲酸對胎鼠的致畸程度不同。在孕7.5 d，維甲酸可引起胎鼠尾椎縮短變形或無尾椎、胸肋骨發育異常等現象(圖3B)；在孕11.5 d，維甲酸主要使胎鼠四肢骨骼發育遲緩，出現四肢長骨的成骨縮短或消失，并抑制指(趾)骨分化；在孕15.5 d，維甲酸對骨骼的致畸作用弱于7.5 d 和11.5 d，但也能在一定程度上使胎鼠四肢長度縮短，指(趾)個數減少，并且影響成骨的骨化。(圖3B～E)。

圖3 維甲酸對不同孕期小鼠骨骼發育的影響Fig.3 The effects of ATRA on bones in different pregnancy time of mice.A.小鼠整體骨骼染色圖；B.不同孕期維甲酸的致畸作用，1為胸肋骨異常，2為尾椎消失，3為橈骨、尺骨縮短，4為后肢發育異常，5為成骨骨化不完全；C、D、E.灌胃時間對胎鼠尾長、前后肢長、指(趾)數的影響。**表示與對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

2.3 維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達水平的影響

Cyp26屬于細胞色素P450超家族成員, 它能編碼特異代謝維甲酸的氧化酶，Cyp26家族有3 種亞家族成員, 即Cyp26a1、Cyp26b1和Cyp26c1[13]。研究表明，CYP26B1是骨骼發育的主要維甲酸代謝酶，它可以降解過量的維甲酸，從而抑制維甲酸的致畸作用[14,15]。而本研究通過熒光定量PCR檢測發現，在孕期11.5 d，給予10 mg/kg的維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達的影響不大，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，當給予50 mg/kg和100 mg/kg維甲酸時，胎鼠Cyp26b1基因表達下降，與對照組比較差異極顯著(P<0.01)(圖4A)。

當控制維甲酸的給予劑量為50 mg/kg 時，不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)對維甲酸在Cyp26b1基因水平上的反應也不相同，隨著孕期天數的增加，胎鼠體內Cyp26b1基因表達水平上升，但Cyp26b1基因的相對表達量都低于對照組(P<0.01)，這說明一定劑量的維甲酸能夠抑制孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)內胎鼠Cyp26b1基因的表達(圖4B)。

圖4 維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達水平的影響Fig.4 The effects ofCyp26b1gene expression levels on fetal rat.A.不同劑量維甲酸對胎鼠Cyp26b1基因表達水平的影響；B.維甲酸對不同孕期胎鼠Cyp26b1基因表達水平的影響。**表示與對照組相比在P<0.01水平上差異顯著。

3 討論

維甲酸是維生素A 在體內代謝的中間產物，過量的維甲酸對大鼠、倉鼠、雞等動物具有致畸性[16～18]。梁天琦[19]用50 mg/kg維甲酸誘導BALB/c小鼠，制作腭裂模型；夏敏杰等[10]研究發現50 mg/kg維甲酸對SD 大鼠胚胎具有明顯的致畸作用；陳默等[9]研究發現80 mg/kg維甲酸是造成小鼠胚胎典型畸形的最佳灌胃劑量。本研究也發現10 mg/kg的維甲酸對胎鼠的四肢、指(趾)數影響較小(圖1)，當維甲酸的劑量達到50 mg/kg和100 mg/kg時，小鼠胚胎四肢、指(趾)數出現畸形，與對照組比較差異顯著(P<0.05)。

對于不同孕期的小鼠，維甲酸的致畸效果也不同。當孕期為7.5 d時，維甲酸主要導致尾椎骨、胸肋骨骨骼的畸變；當孕期為11.5 d時，維甲酸則能使四肢骨骼發育遲緩、抑制指(趾)骨分化；當孕期為15.5 d時，維甲酸對骨骼的致畸作用減弱，主要表現為干預成骨的骨化。這可能是由于在孕娠的不同時間，骨骼發育的次序不同，在7.5 d時主要是胎鼠椎骨和胸肋骨發育時期，此時維甲酸的過量攝入必然導致這些骨骼的發育異常；而當11.5 d時胎鼠四肢骨發育活躍，過量的維甲酸會導致這些骨骼的畸變；當15.5 d時胎鼠的骨骼基本發育完全，因而維甲酸對胎鼠的致畸作用減弱，但此時成骨的骨化還未結束，因而在這一時期維甲酸主要抑制成骨骨化。

CYP26B1細胞色素酶是體內調節維甲酸水平的關鍵酶，它能夠分解代謝維甲酸，在對不同底物代謝效率的競爭性研究中發現，CYP26B1的首選作用底物是反式維甲酸[20]，CYP26B1細胞色素酶在體內的表達量受Cyp26b1基因調控[21]。本研究發現隨著維甲酸劑量的提高，Cyp26b1基因表達水平會下降，當維甲酸給予劑量為50 mg/kg和100 mg/kg時，Cyp26b1基因表達量與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；同時50 mg/kg維甲酸也會引起不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)胎鼠體內Cyp26b1基因表達水平下降(P<0.01)。Cyp26b1基因水平的降低是否引起CYP26B1蛋白酶表達量的下降，CYP26B1蛋白表達量改變后是否改變對維甲酸的降解，從而加深維甲酸的致畸作用，這些都有待于進一步研究。

總之，維甲酸灌胃各組孕娠小鼠，胎鼠骨骼均有不同程度和不同頻率的變短、變小、畸形、缺失以及骨化延遲的現象出現，并且這種畸變隨著維甲酸的給予劑量和小鼠孕期天數的不同而不同，同時維甲酸能夠降低與維甲酸降解酶相關的Cyp26b1基因的表達水平。