胚胎大鼠皮質神經元原代培養及神經元鑒定

黃清霞，盧　靖，張冬梅，王佳雯，王　健*

(1.長春中醫藥大學；2.長春中醫藥大學附屬醫院；3.長春中醫藥大學附屬醫院 實驗中心，吉林 長春130021)

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胚胎大鼠皮質神經元原代培養及神經元鑒定

黃清霞1，盧靖1，張冬梅2，王佳雯3，王健2*

(1.長春中醫藥大學；2.長春中醫藥大學附屬醫院；3.長春中醫藥大學附屬醫院 實驗中心，吉林 長春130021)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0001)

隨著現代神經科學及分子生物學的發展，在多個研究領域中原代大鼠大腦皮層神經細胞的培養日益被廣泛應用，不僅促進了對神經元結構和功能的進一步了解,還為大腦神經系統疾病發病機制研究及藥物的作用機制研究提供了一個平臺。但在具體的實驗操作中,胎鼠大腦皮層神經元的分離和體外培養方面仍然存在一系列問題，如胎鼠胎齡難以控制，新生鼠進行神經元培養時細胞存活率較低，細胞數量少、細胞損傷大及神經元純度欠佳等，嚴重限制了后續研究的進行。因此，本研究在參照相關文獻[1-5]及反復實驗的基礎上，對細胞消化及重懸細胞等步驟進行了適當改進，得到了較理想的培養結果。詳情如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物將適齡的Wistar大鼠(吉大醫學部實驗動物中心提供)雌雄各一只合籠過夜,次日觀察，以見到陰栓開始將該雌鼠單獨飼養并計算時間。以24 h為1 d,至第16 d時可用于實驗。

1.1.2實驗試劑及溶液的配制多聚賴氨酸(分子量70,000-150,000)購自美國Sigma公司。L-谷氨酰胺(200 mM 100X)、DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司。細胞爬片(24孔)購自alafa公司。胎牛血清購自四季青公司。B27、Neurobasal神經元專用培養液、兔抗大鼠一抗、山羊抗兔熒光二抗購自美國life公司。PBS緩沖液pH調至7.3-7.4，高壓滅菌，4℃保存。PDL包被液：用三蒸水配制1 mg/ml的PDL儲液，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。含血清培養液：87%Neurobasal+2%B27(50×)+1%L-glutamine(200 mmol/L)+10%胎牛血清，混勻，4℃保存。無血清培養液：97%Neurobasal+2%B27(50×)+1%L-glutamine(200 mmol/L)，混勻，4℃保存備用。

1.1.3培養板及爬片的預處理用0.1 mmol/ml的多聚賴氨酸，分別包被12孔培養板及24孔爬片(用于神經元鑒定)。37℃孵育箱內放置過夜。多聚賴氨酸預處理24 h后將液體吸出,自然干燥后,無菌超純水沖洗2遍，置超凈臺內備用(避光保存)。

1.2方法

1.2.1神經元體外培養取1只孕第16-18 d的Wistar大鼠,脫錐處死并固定，75%酒精局部消毒腹部，開腹，分離子宮并消毒，迅速穿破羊水取出胎鼠，去除胎盤，將胎鼠置于預冷的PBS溶液內并轉移至超凈臺，無菌條件下用尖鑷剝去硬腦膜，暴露兩側大腦半球，取出大腦，轉移至DMEM溶液中繼續剝軟腦膜，分離出皮層,用PBS平衡鹽溶液清洗2遍，剪成1 mm3或更小碎塊；加胰酶,37℃消化10 min，每隔3 min輕輕搖晃1次,用拋光過的移液管吸取上清，再對剩余組織進行2次消化10 min，吸取上清至等體積DMEM+10%胎牛血清+1‰雙抗中，均勻抽吸20-25次，終止消化，70 μm尼龍網篩過濾雜質，室溫800 r/min離心5 min,棄上清，加入含10%血清的Neurobasal培養液重懸。細胞計數后以9.0×105-1.0×106個/ml的密度將細胞接種至預先處理過的孔板內,12孔板1 ml/孔，24孔板0.5 mL/孔，5%CO2、37℃孵箱孵育，4-5 h后用無血清Neurobasal培養基全量換液。體外培養第3 d以終濃度5μmol/L的阿糖胞苷(抑制膠質細胞生長)作用24 h后換液。此后每3 d換液1次,體外培養第7-12 d的細胞用于實驗。

1.2.2形態學觀察及鑒定細胞種板后,定期在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況并記錄。神經元鑒定：細胞種板的第5 d，在長滿細胞的爬片上加入預冷4%的多聚甲醛，300 μl/孔，4℃固定細胞15 min，沿一邊吸去多聚甲醛，注意不要碰到細胞，PBS洗3次，每次5 min。用0.5%TritonX-100對細胞進行通透，時間為15 min,然后加入封閉液(10%胎牛血清)室溫封閉1 h。小心取出爬片，放在自制板上，一抗(1%胎牛血清1∶1 000稀釋)200 μl/片，垂直加，把爬片鋪滿，放入小盒中，底部放PBS保持濕度，37℃2 h，PBS清洗2次，加入二抗(1%胎牛血清1∶1000稀釋)，室溫避光孵育45 min-1 h。PBS洗1次，室溫下加入33258核染色5 min，在載玻片上用50%丙三醇封片，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞中的陽性細胞數，取平均值作為神經元陽性率。

2結果

2.1神經元純度鑒定

免疫熒光結果顯示，神經細胞占的比例較高，突起走形正常，形態符合神經元的基本特征，核大而清晰，陽性率達90%以上。

2.2倒置相差顯微鏡觀察

觀察剛種板的神經細胞，分布均勻，呈圓形，無色透明，折光性較強(圖1)；1 d后神經元已全部貼壁，細胞數量較多，細胞周邊有光暈，部分細胞呈梭形，有伸長的突起，但細胞間連接較少(圖2)；3 d后細胞形態比較典型：胞體飽滿，大多數細胞呈梭形，少數為多邊形，突觸之間相互連接，可見少數神經膠質細胞(圖3)；4 d加完阿糖胞苷后，背景中幾乎不見扁平多邊形的膠質細胞，神經元胞體逐漸增大,突起進一步延伸并連接成網(圖4)；第7 d，原方法培養的細胞中有部分存活的細胞，但胞體逐漸縮小聚集，突起縮短，細胞抱團，狀態不能用于實驗(圖5)；而用改進后方法培養的細胞，形態良好,連接緊密，分布均勻，可用于實驗(圖6)。

圖1　剛種板神經元形態(20×)　　圖2　培養1 d神經元形態(10×)　　圖3　培養3 d神經元形態(20×)

3討論

大多數文獻報道[6-8]，在消化細胞時，通常用0.25%Trypsin對大腦皮層組織進行一次消化(20 min)，但經過前期的探索研究發現用該法消化得到的細胞損失較大，存活力低，最終達不到實驗要求。其原因可能是Trypsin消化細胞時，先分離下來的細胞易消化過度，最終導致細胞損傷或死亡。經過改進后，本實驗采用2次消化法分離，對細胞損傷更小且獲得的細胞更多。

圖4　培養4d加完阿糖胞苷后神經元形態(20×)　　　圖5　原方法培養7d神經元形態(10×)　　　圖6　改進方法培養7d神經元形態(10×)　　　　　　　　

國內外有關皮質神經元取材公認的是采用胚胎大鼠作為神經細胞培養組織來源的種屬[9]，因為在大鼠胚胎發育16-18 d時細胞正處于分裂時期、繁殖階段，取此時的神經元進行培養，存活的細胞數相對就較多，利用此階段的大鼠胚胎提取神經元可以提高細胞的成活率并能較好地控制雜質細胞的百分含量。但在實際應用中卻較多采用新生鼠培養神經元，因為使用胎鼠難以精確控制胎齡以致費用較高、取材困難等缺點。在本研究中我們采用單獨合籠，觀察陰栓的方法建立了1種低成本并簡便易行的獲得胎鼠以培養神經元的方法。

目前多數文獻報道[10-12]在接種細胞時用加血清的DMEM重懸細胞，12 h后才全量換成神經元培養基，實驗發現這樣不利于神經元生長，換液間隔時間太長，會導致膠質細胞生長過多，細胞純度降低。在本實驗中，我們用含血清的神經元培養液種板，在接種細胞4-5 h時換成無血清培養液培養。胎牛血清能促進神經細胞貼壁，大腦皮層神經細胞種板5 h后細胞大部分已經貼壁牢固而細胞碎片還沒有貼壁完全，此時換液能去除細胞碎片及還未貼壁的膠質細胞[13]。大腦皮層神經元接種超過12 h后，細胞碎片已經貼壁牢固，直接影響神經元的存活，并且膠質細胞已經貼壁生長，所以換培養液時間為4-5 h最適宜。

本研究對神經元培養過程中獲取孕鼠，細胞消化以及培養液等方面進行了改良。在采用此方法以后，無論是在神經元的數量及純度上，或是生長狀態上，都有較大的進步，這對以原代培養神經元作為實驗對象的研究而言尤為重要。

參考文獻：

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摘要：目的對原有的胚胎大鼠神經細胞原代培養進行改進，建立一種高效、穩定的的原代培養方法。方法自精確控制胎齡的大鼠胚胎大腦中分離出皮質，采用胰酶二次消化法制備神經細胞懸液。并選用神經元特異性烯醇化酶免疫熒光化學法對神經細胞進行鑒定。結果與單次消化法分離細胞及運用DMEM+10%胎牛血清重懸細胞進行種板的原方法相比,方法改進以后，細胞提取數量明顯增加,且純度較高。種板后細胞形態正常且能長期存活。結論該方法結果理想,簡易高效,值得借鑒和推廣。

關鍵詞：胎鼠;神經元;原代培養

The primary culture of embryonic rat cortical neurons and neurons identificationHUANGQing-xia,LUJing,ZHANGDong-mei,etal.(TheChangchunUniversityofChineseMedicine；TheaffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a highly efficient and stable method for the primary culture by modified the original method of cultureing embryonic rat cortical neurons.Methods Cerebral cortex isolated from the precise control of gestational age was dissociated to single cells by the twice-enzyme isolation method.Immunofluorescence of neuronspecific enolase chemical methods was used to identify neurons.ResultsThe improved method could markably increase the number of cells and the purity compared to the original method of single digestion method and suspending cells use the DMEM+10%fetal bovine serum.The plateing neurons was eumorphism and has long-time livability.ConclusionThe experimental method has a ideal result also is simple and efficient that is worth to reference and generalize.

Key words:fetal rat;neuron;primary culture

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類號：R741

文獻標識碼：A

文章編號：1007-4287(2016)01-0001-03

*通訊作者

基金項目：國家自然科學基金項目(81473576);吉林省科技廳自然科學基金項目(20150101251JC)；吉林省衛生計生委科研計劃項目(2014Z100)；吉林省中醫藥管理局青年基金項目(2014-Q2)