焦磷酸測序檢測載脂蛋白E基因多態性方法的建立

初亞男，封利穎，吳燕子，張婕妤

0 引 言

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）隸屬于載脂蛋白家族，主要通過與低密度脂蛋白受體和極低密度脂蛋白受體結合參與脂類代謝和膽固醇轉運，也參與神經系統發育、組織損傷后修復、組織再生和脂質的再分布、免疫應答、抗氧化、細胞增殖、分化等，對維持身體健康有重要意義［1-3］。ApoE的編碼基因由于3種異構體所帶電荷存在差異，導致其與相關脂蛋白受體結合的活性不同，進而影響了脂蛋白代謝過程，例如相對ε3等位基因，ε2等位基因往往與甘油三酯水平升高、總膽固醇（Total cholesterol，TC）水平下降有關，而ε4則相反［3］。此外，還有多篇文章報道該位點與阿爾茨海默?。?］、冠狀動脈粥樣硬化［5］、帕金森病以及卒中后抑郁等的發病風險有相關性［6-7］。目前，對于SNP的檢測技術日新月異，主要包括探針雜交技術，Taqman探針技術，高分辨溶解曲線技術以及直接測序技術等［8-9］。但這些方法大多操作復雜，成本昂貴，因而沒有在大規模SNP檢測中得到應用。焦磷酸測序法由于其良好的定量性能，無需電泳或熒光標記，易于自動化等優點已成為 SNP檢測最主要的方法［10］。王丹慧等［11］通過優化焦磷酸測序的推注順序實現同時檢測ApoE基因的2個SNP位點，可以節約一半測序時間和試劑成本，但是該方法的靈敏度較低，需要50 ng的人基因組核酸才能實現檢測，對模板要求較高。Apoe基因中的2個SNP位點所處區域的GC含量高達68%以上，Tm值高于70℃，不利于擴增引物的結合和延伸，容易產生非特異性條帶，不利于后期進行焦磷酸測序，因此需要對擴增條件進行優化才能獲得理想的測序結果。本研究的目的是建立一種基于焦測序技術的高靈敏高特異性rs429358（112T＞C）、rs7412（158C＞T）位點分型方法。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器人基因組提取試劑盒采用Wizard Genomic DNA Purification Kit，焦磷酸測序相關試劑購自德國QIAGEN公司；2×TransTaq?High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix I試劑盒購自北京全式金公司；TaKaRa LA Taq?with GC Buffer試劑盒及TaKaRa TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。其他試劑均為分析純；實驗用水均為滅菌雙蒸水。Q24焦磷酸測序儀購自德國QIAGEN公司，A200基因擴增儀購自杭州朗基科學儀器有限公司，微量紫外分光光度計購自南京伍義科技有限公司。

1.2引物設計和合成在NCBI中查詢到人ApoE基因的序列信息，選擇112和158位點附近的保守區域，使用PyroMark Assay Design 2.0設計焦磷酸測序引物，使用Primer5軟件分析引物的Tm值和二級結構，對引物進行微調整。由于112和158位點相距137個bp，因此我們設計了一個包含兩個SNP位點，總長為276bp的擴增片段，只需要采用不同的測序引物就分別測得兩個SNP的結果。設計得到的引物序列由Invitrogen公司合成，分別為上游引物“5′-AAATCGGAACTGGAGGAA-CAA-3′”，下游引物“Biotin-5′CCCCGGCCTGGTACACT-3′”，112位點測序引物“5′-GCGGACA-TGGAGGACGTG-3′”及158位點測序引物“5′-GCCGATGACCTGCAGAAG-3′”。PCR體系及溫度考察

本研究驗證了TaKaRa公司的普通Taq酶體系（簡稱T體系）、高GC專用的La Taq酶體系（簡稱L體系）和全式金公司高GC專用的Trans Taq酶體系（簡稱TT體系）。其中T體系包括：10×buffer 5μL，MgCl22 mmol/L，dNTP 200 μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L，DNA 模板2μL，Taq酶1.25 U，加水補充至 50μL。L體系包括：10×高 GC buffer 25μL，dNTP 400μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L，DNA模板2μL，La Taq酶2.5 U，加水補充至50μL。TT體系包括：2*Trass Taq High Pidelity（包含熱啟動酶，反應 Buffer，dNTP）25μL，上下游引物各 0.4μmol/L，DNA模板2μL，加水補充至50μL。

同時，本研究也考察了60°C循環程序及62-68°C梯度升溫循環程序，作為最適應溫度優化。其中60°C循環程序為：94°C預變性5 min，94°C變性30 s，60°C退火30 s、72 °C延伸30 s，共35個循環，最后72°C延伸7 min。62～68°C梯度升溫循環程序為：94°C預變性5 min，94°C變性30 s，62°C到68°C退火30 s每個循環升1°C ，72°C延伸30 s，共6個循環，94°C變性30 s，60°C退火30 s、72°C延伸30 s，共29個循環，最后72°C延伸7 min。

1.3焦磷酸測序方法特異性考察從我科的臨床基因檢測擴增檢驗實驗室收集到的人基因組核酸標本庫中隨機挑選20份標本，采用最優條件進行擴增，取同管產物一部分用于焦磷酸測序，一部分用于Sanger測序，將兩者對112和158位點的測序結果進行比較。同時將Sanger測序得到的序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對，分析序列的來源是否為人源ApoE基因。

1.4焦磷酸測序方法靈敏度考察將已知基因型的標本用純水進行梯度稀釋，得到濃度為10、2、0.4、0.08 ng/μL標本及純水0 ng/μL作為模板。對各梯度模板擴增后進行焦磷酸測序，在相應堿基位置有信號峰出現，且信號峰比例符合預期的判定為測序正確。設置112位點測序推注順序為“TTCCGC”其中第1個“T”為112位點的野生型信號峰，第2個“T”可獲知T堿基的測序本底，同理C堿基為突變型信號峰。在焦磷酸測序儀的試劑倉中依次加入A、C、G、T4種堿基，測序底物（S）和酶（E），運行程序10 min后得到相應測序圖譜。同理設置158位點的推注順序為“TTCCGC”，“T”為突變型信號峰，“C”為野生型信號峰。

2 結 果

2.1 PCR體系及溫度考察結果3種擴增體系僅L體系獲得了位于276 bp的單一目標產物。62～68℃梯度升溫循環程序下L體系和TT體系獲得了位于276 bp的單一目標產物，見圖1。實驗結果表明62～68℃梯度升溫循環程序的設置可以顯著降低非特異性擴增，但同時對目的產物的終濃度也會造成影響。綜合電泳條帶亮度、特異性，60℃循環程序和L體系為最優組合。

2.2焦磷酸測序方法特異性考察結果從標本庫中隨機挑選20份標本焦磷酸測序，結果如下，112T＞C位點TT型15份、TC型5份，CC型0份。158C＞T位點TT型0例、TC型4份，CC型16份。20份標本2個SNP位點的Sanger測序結果與焦磷酸測序結果一致。將多態性分析結果同Sanger測序結果進行比較，與Sanger測序完全一致。將Sanger測序獲得的基因序列進行BlAST比對，該序列與GenBank中人載脂蛋白E基因的堿基序列100%匹配。說明本方法的特異性良好。

2.3焦磷酸測序方法靈敏度考察112T＞C位點和158C＞T位點均可檢出低至0.16 ng的人基因組DNA，見圖2，信號峰比例正常，能明顯區分于本底信號峰。

圖1 3種PCR體系優化結果Figure 1 Results of three PCR buffer seletion at annealing temperature

圖2 不同條件下靈敏度檢測結果Figure 2 Sensitivity of the 1112T＞C site and 158C＞T site

3 討 論

有研究發現ApoE各基因型與TC和LDL-C水平存在顯著性關聯。其中ε4基因型的患者總膽固醇和低密度脂蛋白濃度的平均水平偏高。由于冠心病的發病危險因素之一就是高血脂，且與TC和LDL-C的水平更為相關［12-13］，所以對ε4基因型攜帶者可以及早進行干預。以飲食、藥物、生活方式為干預手段，制定健康管理方案，以此預防或延緩冠心病的發生或發展。該基因在他汀類個體化用藥方面也具有一定意義，一項對16個候選基因中的43個SNP位點的研究發現，ApoE基因158位點CT和TT型患者對阿托伐他汀的治療反應較好［14］。因此ApoE基因在結果解讀時，應該聯系患者的疾病發生風險、血脂、他汀類藥物療效等方面綜合進行解讀。目前已經獲得CFDA批準的ApoE基因分型檢測試劑盒分別基于基因芯片和熒光PCR技術平臺?；蛐酒z測ApoE基因需要經過核酸純化、雜交、洗脫、顯色等步驟，對實驗人員的操作要求較高且步驟繁瑣。熒光PCR方法由于屬于閉管檢測，可以有效避免氣溶膠污染，但是由于該方法是基于核酸雜交進行基因序列分析，所以屬于間接方法，如果在目標區域內存在序列變異時容易造成檢測誤差。本研究建立的焦磷酸測序方法屬于直接測序法，是核酸序列分析的金標準，通過體系優化本研究建立的ApoE基因焦磷酸測序檢測方法具備特異性好靈敏度高的優點，最低可檢測0.16 ng的人基因組核酸，因此本方法可適用于紙片血、咽拭子等核酸含量較低的標本來源，減輕患者采樣負擔，更好的滿足臨床檢測?？傊?，本研究建立了一個可以在臨床檢測ApoE基因112和158位點變異的方法。該方法將有望應用于患者疾病發生風險預測及藥物合理使用等方向。