血管內皮生長因子C和皮層肌動蛋白在食管鱗癌細胞中的表達及其臨床意義

楊 陽，李校天，張九娜，周麗云，郭永澤

0 引 言

食管癌為常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著科學診療技術的發展，食管癌的靶向治療成為新的研究熱點，但尚未有大型的專門針對食管鱗癌靶向治療的相關研究［1］。研究發現，血管內皮生長因子C（Vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的表達在食管鱗癌組織中明顯高于食管正常黏膜組織［2］；皮層肌動蛋白（Cortactin，CTTN）在多種不同來源的腫瘤細胞中存在過表達現象且其與食管鱗癌的臨床分級密切相關［3-6］。更有研究報道VEGFC、CTTN兩分子與促進食管癌生長及淋巴轉移密切相關，且兩分子之間可能存在一定的相關性，但其具體分子機制及其作用關系尚未明確［7-9］。據統計學資料顯示，我國臨床上確診的食管癌病例中以食管鱗癌較為多見，而大多數食管鱗癌患者在產生臨床癥狀及就診之前往往早已發生淋巴轉移，故早期發現并控制疾病發展是治療的關鍵［10-11］。因此，本研究通過體外分別干擾人食管鱗癌TE1細胞中VEGFC、CTTN的基因表達，探討兩因子對食管鱗癌細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要實驗儀器及試劑人食管鱗癌TE1細胞株（河北醫科大學第二附屬醫院實驗室惠贈），RPMI Medium1640培養基（Solarbio），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），VEGFCsiRNA、CTTNsiRNA、陰性對照RNA、陽性對照RNA、siRNA-MATETM轉染試劑（蘇州吉瑪基因股份有限公司），CCK-8試劑盒（Solarbio）、流式細胞凋亡檢測試劑盒（Solarbio）、TRIzolTM試劑（艾德萊生物），Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑（TAKARA公司，日本）。

1.2實驗分組實驗根據添加不同試劑分為：空白組（單純培養細胞）、MATE轉染試劑組（添加MATE試劑）、陰性對照組（添加陰性對照RNA及MATE試劑）、陽性對照組（添加陽性對照RNA及MATE試劑）、VEGFCsiRNA轉染組（添加VEGFCsiRNA及MATE試劑）、CTTNsiRNA轉染組（添加CTTNsiRNA及MATE試劑）。各轉染基因序列依次為：陰性對照RNA sencine5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′antisencine5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；陽 性 對 照 RNA sencine5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′antisencine5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′；VEGFCsiRNAsencine5′-CACCUUCUUUAAACCUCCATT-3′antisencine5′-UGGAGGUUUAAAGAAGGUGTT-3′；CTTNsiRNA sencine5′-CCAUGGCUAUGGAGGGAAATT-3′antisencine5′-UUUCCCUCCAUAGCCAUGGTT-3′。

1.3轉染轉染前24h將細胞接種在96孔板中，以轉染時細胞的匯合度在30%～45%為宜。轉染前，取125μLDEPC水于1OD的siRNA干粉管中稀釋至20μmol/L。取 0.2μL的上述siRNA溶液加入到50μL無血清1640中，輕輕混勻。加入1μL的siRNA-MATE，加入后立即充分混勻（可用振蕩器振蕩10 s以上），室溫放置10 min（保證足夠時間靜置，且孵育時間≤30min），形成siRNA-siRNA-MATE復合物。在復合物孵育的10min內，從細胞培養板中移除原有的培養基。每孔加入100μL預熱的完全培養基（含10%血清和抗生素）。將siRNA-siRNAMATE復合物50μL滴加到包含細胞和培養基的孔中并輕晃搖勻。將培養板放置于37℃，CO2培養箱孵育24h。

1.4細胞總RNA提取取對數生長期食管鱗癌細胞接種于6孔板，按上述分組干預24h后，棄去培養基，用TRIzol收集細胞提取總RNA。分光光度計檢測RNA的濃度和純度，A260/A280為1.8～2.0時表明提取的RNA純度較高，可用于熒光定量檢測。

1.5逆轉錄反應分別于冰上配置逆轉錄反應液，加入上述提取的RNA溶液共200ng，Olig（dT）18試劑0.5μL，Random primer試劑 0.5μL，并加入 RNase free ddH2O最終配成共12μL的反應液，于70℃下作用10min后迅速將其冷卻1min；然后依次加入10mmol/L的dNTP Mixture試劑0.5μL、RNase inhibitor（40U/μL）試 劑 0.25μL、5xM-MLV buffer試 劑4.0μL、RTase M-MLV（RNase H-）試劑 0.5μL，加入ddH2O使其最終達到20μL，將溶液混勻后于42℃恒溫下作用60min，再于72℃滅活15min，最后于-20℃保存備用。該步驟及所需試劑均參考Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）逆轉錄試劑說明書進行。

1.6 RT-PCR反應提前設計所需的特異性的正反向引物，具體引物序列依次為：GAPDHrRNA（內參）Forward5′-TCCACTGGCGTCTTCACCACCAT-3′Reverse5′-GGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG-3′；VEGFC Forward5′-TTGCCAATCACACTTCCTGCC-3′Reverse5′-TCTTGTTCGCTGCCTGACACT-3′；CTTN Forward5′-CAGGCCGACCGAGTAGACAAGA-3′Reverse5′-CGATACCGTATTTGCCGCCGAA-3′。具體配置反應液步驟依次為：正向引物、反向引物各 0.5μL，AceQTMqPCR SYBR? Green Master Mix 10uL，cDNA 2uL（cDNA 稀釋 10倍），ddH2O 7μL。將配好的液體放置于RT-PCR儀上并使用ViiA7TMSystem software軟件設定反應程序，設定反應條件依次為：首先95oC 1min；其次95oC 10s，59oC 20s（此步驟收集熒光信號），該步驟共進行45個循環；再于60oC～95oC進行溶解曲線分析。采用Applied Biosystems ViiA 7TMReal-Time PCR System檢測各個基因的Ct值，所有反應均設3個復孔。根據Comparative Delta-delta Ct法△△Ct=（Ct基因-Ct內參基因）-（Ct基因-Ct內參基因）對照組，利用2-△△CT計算各個基因相對于對照組的表達量。

1.7 CCK8檢測細胞增殖情況細胞接種于96孔板，待細胞長至30%～45%時，按上述步驟進行分組干預，每組設4個復孔。干預24h后，每孔加入10μL CCK-8，于培養箱內孵育約1h，使用酶標儀測定450nm波長處吸光度值（A值）。細胞存活率計算公式如下：

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取對數生長期食管鱗癌細胞接種于6孔板，按上述分組干預24h后，棄去培養基，胰蛋白酶消化細胞，以1mL1xBinding Buffer懸浮細胞，4℃ 1200轉/min離心5min，棄上清，PBS洗2次，1mL 1xBinding Buffer結合緩沖液重懸細胞后，細胞密度為1×106個/mL，每管取出100uL液體（細胞密度1×105個/mL）分別加入5μL AnnexinV-FITC混勻后室溫避光孵育10min，加入5μL PI室溫避光孵育5min，再于每管加入400μL PBS至500μL液體后，輕柔渦旋混勻，于1h內上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.9統計學分析采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。實驗數據以均數和標準差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGFCmRNA及CTTNmRNA的相對表達量的比較VEGFCsiRNA轉染組VEGFC mRNA表達量、CTTNsiRNA轉染組CTTN mRNA表達量較空白組明顯降低（P＜0.05）。證明轉染成功。見表1。

表1 各組VEGFC及CTTNmRNA相對表達量的比較（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

表1 各組VEGFC及CTTNmRNA相對表達量的比較（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

與空白組比較，*P＜0.05

組別空白組MATE轉染組陰性對照組陽性對照組VEGFCsiRNA轉染組CTTNsiRNA轉染組CTTNmRNA相對表達量1.00±0.00 1.05±0.08 0.98±0.08 1.00±0.02 0.97±0.03 0.29±0.02*VEGFCmRNA相對表達量1.00±0.00 0.94±0.01 0.93±0.01 0.97±0.04 0.13±0.01*0.96±0.01

2.2各組食管鱗癌細胞增殖率VEGFCsiRNA轉染組及CTTNsiRNA轉染組細胞增殖率較其他組均明顯降低（P＜0.05），VEGFCsiRNA轉染組細胞增殖率較CTTNsiRNA轉染組明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3流式細胞儀檢測食管鱗癌細胞凋亡率VEGFCsiRNA轉染組、CTTNsiRNA轉染組細胞凋亡率均較其他組明顯增高（P＜0.05），VEGFCsiRNA轉染組細胞凋亡率較CTTNsiRNA轉染組明顯增高（P＜0.05）。見表2。

表2 食管鱗癌細胞增殖率及凋亡率實驗結果（xˉ±s，%）Table 2 Proliferation and apoptosis of the ESCC cells in different groups（xˉ±s，%）

3 討 論

食管癌為我國十大惡性腫瘤之一，據統計我國以食管鱗狀細胞癌為主要病理組織類型［12-13］。VEGF又稱血管內皮生長因子，其中VEGFC是VEGF家族中最強的促淋巴管生成因子［14-15］，它能夠調節細胞生物學行為及細胞惡變的發生［16］。CTTN常被稱為皮層肌動蛋白，該基因是位于染色體11q13區上的癌基因［17］，既往研究證實CTTN是腫瘤細胞侵襲性偽足的主要功能蛋白［18］。研究顯示VEGFC、CTTN與多種腫瘤致病相關［19-22］，更有學者認為兩分子與食管鱗癌的癌細胞轉移及生存活力密切相關［23］。因此本實驗對VEGFC、CTTN在食管鱗癌中的表達及其臨床意義進行探討。

為進一步證實VEGFC、CTTN在食管鱗癌中的表達情況及其相關作用關系，本研究前期通過免疫組織化學等實驗方法，證實了VEGFC、CTTN在食管鱗癌組織中成高表達，食管鱗癌的浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移及淋巴管浸潤與食管鱗癌組織中VEGFC、CTTN的表達密切相關等［24］。該結論為本實驗細胞學研究提供了強有力的理論支撐，在此基礎之上，本實驗參照既往shRNA干擾沉默ERCC1對A549/DDP細胞增殖與凋亡的成功案例［25］，并通過對siRNA干擾食管鱗癌細胞目的基因表達技術知識［26］，開展了siRNA基因干擾技術，在肯定了既往研究結果的基礎之上，新技術的開展也為本課題的研究開創了新的思路與方法。

本實驗主要是對食管鱗癌細胞研究，通過RTPCR對各實驗組VEGFC、CTTN的相對mRNA表達量的檢測，充分證實了VEGFCsiRNA及CTTNsiRNA轉染成功，并肯定了siRNA技術干擾食管鱗癌細胞目的基因表達的可行性。通過對各組CCK8結果及流式細胞儀檢測結果的對比分析證實了成功干擾食管鱗癌細胞VEGFC、CTTN表達后均可抑制食管鱗癌細胞增殖并促進其凋亡，并通過對結果的分析對比明確了干擾VEGFC的表達對食管鱗癌細胞增殖、凋亡的影響作用大于CTTN。因此本實驗結果充分肯定了VEGFC、CTTN與食管鱗癌細胞生長密切相關等實驗結論。

綜上所述，本實驗從細胞分子學角度入手，通過成功實施細胞學基因干擾技術證實了分別干擾VEGFC、CTTN表達均可抑制食管鱗癌細胞增殖并促進其凋亡，且VEGFC較CTTN對食管鱗癌的生長及凋亡影響作用更為顯著等結論，為下一步明確兩基因促進食管鱗癌淋巴浸潤的分子機制奠定了基礎。